紫杉-4(5),11(12)-二烯合酶(Taxa-4(5),11(12)-diene synthease,TS)是紫杉醇生物合成中關鍵的限速酶,可以催化牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)環(huán)化成紫杉烷類化合物的基本骨架紫杉-4(5),11(12)-二烯。紫杉二烯合酶基因TS在植物中的存在是該種植物能夠合成紫杉醇的分子層面的最好證據(jù)。本研究利用高通量測序技術測得報道檢測到紫杉醇的植物白豆杉(Pseudotaxus chienii)、穗花杉(Amentotaxus argotaenia)、香榧(Torreya grandis)轉錄組,通過對這些植物和平榛(Corylus heterophylla Fisch)的轉錄組數(shù)據(jù)進行TS基因的預測,并利用體外表達體系對其進行功能鑒定。通過實驗發(fā)現(xiàn),我們篩選的TS候選基因中只有白豆杉中表達的PchTS具有紫杉二烯合酶的功能。本實驗室對粗榧的CsTSL研究發(fā)現(xiàn)其能夠催化GGPP得到verticiol,而在本研究中發(fā)現(xiàn)白豆杉中的PchTS能夠催化GGPP得到紫杉二烯。此結果是否說明存在紫杉二烯合酶基因在不同植物中的進化現(xiàn)象?通過活性位點分析發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd)中的TchTS和粗榧中的CsTSL之間存在兩個活性位點的不同,這兩個位點都存在于具有結合及催化活性的α結構域內。我們進一步用TchTS的α結構域換掉CsTSL的α結構域,看能否實現(xiàn)其TS功能的回補。但是,粗榧CsTSL的α結構域置換實驗并未達到CsTSL回補TS功能的效果。本研究通過對這些TS候選基因分析發(fā)現(xiàn)古老的二萜合酶TS可能在植物中不是普遍存在的。本文主要研究結果如下:1.對白豆杉進行轉錄組測序,并對預測的TS候選基因進行功能驗證。首先對白豆杉轉錄組測序,共得到約8.60 Gb的Clean data,組裝得到78,192條Unigene。通過對白豆杉的轉錄組注釋分析發(fā)現(xiàn)42,465條Unigene至少被注釋到一個數(shù)據(jù)庫。KEGG注釋發(fā)現(xiàn)有63條Unigene被注釋到萜類骨架生物合成中,有19條Unigene注釋到了二萜生物合成途徑中。我們利用已知的紫杉醇合成途徑基因序列信息,通過對白豆杉轉錄組的分析預測得到了3個紫杉二烯合酶同源基因、6個羥基化酶同源基因、4個�；D移酶同源基因、3個苯丙氨酸氨基變位酶基因同源基因和5個R-β-苯丙氨酸輔酶A連接酶。然后,克隆得到與TchTS基因同源性最高的PchTS基因,并對其進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)PchTS具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我們對白豆杉樹皮的化學成分分析,并未檢測到紫杉醇。這有可能是白豆杉中紫杉醇合成途徑下游的某個酶功能缺失或沉默造成的。2.對穗花杉進行轉錄組測序,并對預測的ts候選基因進行功能驗證。首先對穗花杉轉錄組測序,共得到8.14gb的cleandata,組裝得到82,884條unigene。其中,有27,495條unigene至少得到一個數(shù)據(jù)庫的注釋。kegg注釋發(fā)現(xiàn)有43條unigene被注釋到萜類骨架生物合成中,有20條unigene注釋到了二萜生物合成途徑中。同時,kegg注釋得到5個ggps基因。利用tchts蛋白質序列對穗花杉的轉錄組進行分析,預測得到13個紫杉二烯合酶同源基因。然后,利用race技術克隆了穗花杉中同源性最高的基因aartsl1的全長克隆,并對其進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)aartsl1不具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我們對穗花杉樹皮的化學成分分析,并未檢測到紫杉醇。這說明穗花杉可能不具有合成紫杉醇的能力。3.對香榧進行轉錄組測序,并對預測的ts候選基因進行功能驗證。首先對香榧轉錄組測序,共得到7.68gb的cleandata,組裝得到85,984條unigene。其中有29,418條unigene得到至少一個數(shù)據(jù)庫的注釋。kegg注釋發(fā)現(xiàn)共有5,893個unigene得到注釋。利用blast技術對香榧轉錄組進行分析,其中發(fā)現(xiàn)了3個紫杉二烯合酶同源基因。然后,克隆得到與tchts基因同源性最高的tgrtsl1基因,并對其進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)tgrtsl1不具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我們對香榧樹皮的化學成分分析,并未檢測到紫杉醇。這說明香榧可能不具有合成紫杉醇的能力。4.對平榛(c.heterophylla)中的tsl基因進行功能研究。首先,通過分析平榛轉錄組得到一個ts基因候選unigene。然后利用race-pcr技術克隆得到基因全長,并命名為chetsl。然后,利用原核表達體系對其進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)chetsl不具有紫杉二烯合酶的功能。但是,進一步分析發(fā)現(xiàn)該基因是一個貝殼杉烯合酶(kaurenesynthase,ks)基因。目前,仍然沒有人能夠從榛屬植物中克隆得到ts基因,所以榛屬植物中紫杉醇的來源仍然是一個迷。5.對tchts、pchts和cstsl蛋白進行活性位點研究。首先,利用分子對接技術對紫杉二烯合酶具有活性的α結構域進行分析,分析上述三個蛋白的α結構域的活性位點,從中找出它們之間存在差異的活性位點。通過用2-氟代牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(2-fluorogeranylgeranyldiphosphate,fgp)與tchts、pchts和cstsl蛋白進行分子對接,發(fā)現(xiàn)紅豆杉中TchTS與白豆杉中PchTS的活性位點完全一樣。然而,粗榧中CsTSL與紅豆杉中的TS之間有2個活性位點的差異,分別是TchTS的VAL610與CsTSL的PHE637,和TchTS的PHE834與CsTSL的ILE860。分析發(fā)現(xiàn)這兩個具有差異的活性位點恰好都位于α結構域內。因此,我們進一步利用具有活性的TchTS的α結構域換掉CsTSL的α結構域試圖回補CsTSL的TS功能,但是該實驗并未能夠回補CsTSL的TS功能。最后,我們對粗榧樹皮的化學成分進行了分析并未檢測到紫杉醇。CsTSL基因可能是粗榧中進化后失去功能的紫杉二烯合酶基因。
【學位單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：Q946
【部分圖文】：

Tab. 2-2 The statistical result of functional annotation of P. chienii Unigene注釋用數(shù)據(jù)庫Anno_Database注釋的 Unigene 數(shù)目Annotated_Number300<=長度<1000300<=length

第二章 基于轉錄組測序的紫杉二烯合酶候選基因的發(fā)掘metabolism）和“氨基酸的運輸和代謝”（amino acid transport and metabolism）是最大的 個類群，分別有 3,836、1,767 和 1,669 條 Unigene。然而，“胞外結構（”extracellular structures是最小的類群，只有 1 條 Unigene（圖 2-1）。對 78,192 條 Unigene 進行 GO 功能注釋，其中有 23,454 條 Unigene 分別注釋到 5個功能組，歸納為生物學過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）三大部分，分別含有 20、16 及 16 個功能組。在生物學過程部分中注釋的 Unigene 數(shù)目最多的過程是：代謝過程（metabolic process）和細胞過程（cellular process），分別為 16,540 和 12,948 條；在細胞組分部分中注釋的 Unigene 數(shù)目多的功能組是：細胞組分（cell part）和細胞（cell）功能組，分別為 9,544 和 9,460 條；在分子功能部分中，催化活性（catalytic activity）和結合（binding）功能組分別含有 13,54和 11,010 條（圖 2-2）。

圖 2-3 紅豆杉紫杉二烯合酶及白豆杉中的同源蛋白序列分析豆杉中紫杉二烯合酶的同源基因的多序列比對；B：白豆杉中紫杉二烯合酶的e protein sequences analysis of TchTS in T. chinensis and the homologous protein ochieni.omparison of the deduced amino acid sequence of the three putative TS genes in P. : Phylogenetic analysis of the TS genes in P. chienii and T. chinensis.
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3 趙凱;王歆;李秀涼;張新建;肖珊;平文祥;周東坡;;東北紅豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其與紫杉醇產(chǎn)生菌基因組DNA的Southern雜交(英文)[J];黑龍江大學自然科學學報;2010年06期

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本文編號：2835101