細(xì)胞通過激活一系列的生物過程,包括新陳代謝、轉(zhuǎn)錄、生長和分化等,對各種各樣的外源性刺激如金屬壓力、生長因子和激素的刺激等產(chǎn)生響應(yīng)。必需金屬元素的過量或缺乏,或者非必需金屬元素的存在都將干擾這些響應(yīng)信號行使正確的生物功能。非必需金屬元素,如鎘、汞、鉛,即使痕量的存在,它們對生物體也形成一定的毒性。而必需金屬元素,如鋅和銅,它們雖然是蛋白質(zhì),尤其是酶和轉(zhuǎn)錄因子不可缺少的一部分,但是過量鋅、銅的存在也會對生物體形成毒性。因此,細(xì)胞進(jìn)化并形成了輸入、屏蔽、存儲、轉(zhuǎn)運及排出重金屬元素這一精細(xì)的調(diào)節(jié)金屬平衡的生物系統(tǒng)。所有生物都能夠由這一自平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)整它們體內(nèi)相關(guān)基因組或蛋白質(zhì)組的表達(dá)模式,對外源性的重金屬刺激或壓力做出適應(yīng)性的響應(yīng),以減少或避免金屬刺激的損害。這些基因組或蛋白質(zhì)組的金屬誘導(dǎo)表達(dá)模式不僅具有組織、細(xì)胞、濃度特異性,而且具有時間依賴性。觀察細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和金屬元素的時間依賴性差異表達(dá)和變化有助于了解細(xì)胞對外源刺激的動態(tài)響應(yīng)過程,對探索自平衡調(diào)節(jié)和防御以及細(xì)胞毒性機制具有重要意義。本論文以A549細(xì)胞系作為細(xì)胞模型,運用高通量、高分辨的雙向凝膠電泳-質(zhì)譜(2DE-MS)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法描繪了A549細(xì)胞暴露于外源金屬離子后,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組對外源重金屬離子必需元素鋅和非必需元素鎘刺激產(chǎn)生的時間依賴性響應(yīng),并采用Western blot和RT-PCR技術(shù)研究了A549細(xì)胞中鋅離子自平衡調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)及其mRNA和鎘毒性蛋白質(zhì)及其mRNA對金屬離子響應(yīng)的時間依賴性變化,同時運用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)和共聚焦顯微成像技術(shù)研究了細(xì)胞內(nèi)重金屬元素或離子的含量在細(xì)胞內(nèi)的時間依賴性變化,探索了細(xì)胞對金屬離子暴露產(chǎn)生的時間依賴性動態(tài)響應(yīng)的過程。本論文的工作主要包括以下5個部分：(1)運用基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)一級質(zhì)譜(MS)分析了桿菌肽鋅的主要成份；在優(yōu)化的儀器條件下,利用單張二級質(zhì)譜圖(MS/MS)獲得了具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的十二金屬環(huán)肽桿菌肽鋅A的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的序列信息；運用從頭序列解析(De novo sequencing)的方法對多肽進(jìn)行了氨基酸序列的分析和確認(rèn)。此外,運用紅外光譜、紫外光譜、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)等方法進(jìn)一步分析表征了這個典型金屬多肽抗生素的結(jié)構(gòu)。(2)運用Western blot和RT-PCR技術(shù)研究了鋅平衡信號通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)金屬轉(zhuǎn)錄因子(MTF-1)、金屬硫蛋白(MT-1)以及Zn轉(zhuǎn)運子(ZnT-1和ZIP-1)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對外源鋅刺激呈現(xiàn)出的時間依賴性差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)了它們所具有的對外源鋅刺激產(chǎn)生的時間依賴性表達(dá)的特性。這些蛋白質(zhì)的表達(dá)隨著外源鋅刺激時間的不同發(fā)生保守的變化,其表達(dá)主要受鋅刺激的誘導(dǎo),并且均在外源鋅刺激細(xì)胞9 h后呈現(xiàn)最大的變化,基于此,推測了由這些關(guān)鍵蛋白質(zhì)調(diào)控的Zn的自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程。(3)運用結(jié)合硝酸銀染色和考馬斯亮藍(lán)染色的2DE技術(shù)分別呈現(xiàn)了外源.鋅刺激A549細(xì)胞不同時間后細(xì)胞全蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜,并對差異表達(dá)蛋白質(zhì)點的差異表達(dá)情況進(jìn)行歸類和統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)了以兩種表達(dá)模式為主的四種表達(dá)類型,總結(jié)出差異表達(dá)蛋白質(zhì)在細(xì)胞暴露于24 h后的表達(dá)總是低于9 h,即外源鋅長時間刺激細(xì)胞能夠?qū)е虏町惐磉_(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)的進(jìn)一步降低這一差異表達(dá)規(guī)律,據(jù)此,指出蛋白質(zhì)時間依賴性表達(dá)的特性對金屬離子響應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要影響;運用MALDI-TOF/TOF和Mascot數(shù)據(jù)庫搜索對差異表達(dá)蛋白質(zhì)點進(jìn)行了分析和鑒定,并對已鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物過程和分子功能等功能分類分析,進(jìn)一步了解外源鋅刺激涉及的細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。(4)運用Bradford和ICP-MS技術(shù)研究了全細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)總蛋白質(zhì)表達(dá)量的時間依賴性變化規(guī)律,并運用共聚焦顯微成像技術(shù)研究了自由Zn(Ⅱ)在細(xì)胞中的含量和分布時間依賴性的變化情況,進(jìn)一步驗證了細(xì)胞對外源鋅刺激因適應(yīng)性反應(yīng)表現(xiàn)出的時間依賴性響應(yīng)特性,并探索了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Zn(Ⅱ)平衡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。(5)與對細(xì)胞暴露外源鋅的研究類似,我們首先獲得了外源毒性重金屬離子Cd(Ⅱ)刺激A549細(xì)胞后的細(xì)胞全蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜,研究了相關(guān)差異蛋白質(zhì)對外源金屬離子刺激的時間依賴性響應(yīng)的規(guī)律,類似地,發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)蛋白質(zhì)的四種表達(dá)模式,但Cd(Ⅱ)響應(yīng)蛋白質(zhì)組表達(dá)模式與規(guī)律和Zn(Ⅱ)響應(yīng)具有顯著不同的特點：(1)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)隨著外源鎘刺激時間的不同發(fā)生保守的變化,其表達(dá)同樣主要受鎘刺激的誘導(dǎo),但均在外源鎘刺激細(xì)胞24 h后呈現(xiàn)最大的變化；(2)外源鎘長時間刺激細(xì)胞(24 h)比短時間(4.5 h)導(dǎo)致差異表達(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化增大；運用Western blot、RT-PCR、Bradford和ICP-MS技術(shù)進(jìn)一步研究了細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵鎘毒性蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,細(xì)胞中總蛋白質(zhì)濃度以及Cd、Zn、Cu、Co、Mn等金屬離子含量的時間依賴性的變化情況,初步探討了產(chǎn)生鎘毒性的信號過程。研究結(jié)果表明,細(xì)胞及其內(nèi)的蛋白質(zhì)組對外源性金屬離子刺激的響應(yīng)盡管有所不同,但均呈現(xiàn)出特異性的時間依賴性。我們發(fā)現(xiàn),這種適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)所引起的時間依賴的特異性響應(yīng)和表達(dá)在蛋白質(zhì)組研究和信號機制研究中具有重要的意義,將為研究細(xì)胞內(nèi)金屬自平衡調(diào)節(jié)和毒性提供一個新的角度。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q25
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一章 緒論
    1.1 前言
    1.2 金屬的分布和危害
    1.3 鋅（Zn）
        1.3.1 鋅的分布和來源
        1.3.2 鋅的生物必需性和生物毒性
        1.3.3 鋅的分子生物功能
        1.3.4 鋅的動態(tài)自平衡調(diào)節(jié)
        1.3.5 鋅自調(diào)節(jié)平衡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)
            1.3.5.1 金屬硫蛋白質(zhì)（MT）
            1.3.5.2 鋅鐵調(diào)控蛋白質(zhì)（ZIPs）
            1.3.5.3 鋅鐵調(diào)控蛋白質(zhì)（ZnTs）
            1.3.5.4 金屬響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1（MTF-1）
    1.4 鎘（Cd）
        1.4.1 鎘的分布和來源
        1.4.2 鎘對人體健康的影響
        1.4.3 鎘毒性的分子機理
        1.4.4 鎘毒性相關(guān)主要生物分子
            1.4.4.1 酶
            1.4.4.2 谷胱甘肽
            1.4.4.3 熱應(yīng)激蛋白質(zhì)
            1.4.4.4 金屬硫蛋白
    1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)
        1.5.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的起源
        1.5.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的分類
        1.5.3 差異蛋白質(zhì)組學(xué)
        1.5.4 研究差異蛋白質(zhì)組學(xué)的主要技術(shù)
            1.5.4.1 二維凝膠電泳
            1.5.4.2 樣品的制備
            1.5.4.3 等電聚焦
            1.5.4.4 SDS-PAGE
            1.5.4.5 凝膠圖像的可視化
        1.5.5 生物質(zhì)譜技術(shù)
        1.5.6 生物信息學(xué)分析
    1.6 其它蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)與方法
        1.6.1 熒光差異凝膠電泳（DIGE）
        1.6.2 iTRAQ技術(shù)
        1.6.3 蛋白質(zhì)芯片
        1.6.4 蛋白質(zhì)組學(xué)的現(xiàn)狀和發(fā)展
    1.7 蛋白質(zhì)組學(xué)在重金屬毒性研究中的意義
        1.7.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在重金屬毒性研究中的優(yōu)勢
        1.7.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在重金屬毒性研究中的應(yīng)用
    1.8 選題思想和研究內(nèi)容
    參考文獻(xiàn)
第二章 桿菌肽鋅的序列解析和光譜表征
    摘要
    2.1 前言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 材料和試劑
        2.2.2 儀器和實驗條件
    2.3 結(jié)果和討論
        2.3.1 儀器條件的優(yōu)化
        2.3.2 桿菌肽鋅的一級質(zhì)譜
        2.3.3 多肽序列離子和碎片離子的定義
        2.3.4 桿菌肽A的MS/MS從頭測序分析
        2.3.5 桿菌肽鋅的紫外光譜
        2.3.6 桿菌肽鋅的紅外光譜
        2.3.7 電感耦合等離子體發(fā)射光譜分析桿菌肽鋅中的鋅元素
    2.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第三章 鋅響應(yīng)蛋白質(zhì)組及其調(diào)控蛋白質(zhì)的時間依賴性表達(dá)
    摘要
    3.1 前言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 實驗材料和試劑
        3.2.2 實驗方法
            3.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2.2.2 外源鋅對細(xì)胞的壓力
            3.2.2.3 細(xì)胞活性分析
            3.2.2.4 2DE和Western blot蛋白質(zhì)樣品的制備
            3.2.2.5 二維凝膠電泳和圖像分析
            3.2.2.6 蛋白質(zhì)鑒定
            3.2.2.7 Western blot
            3.2.2.8 RT-PCR
            3.2.2.9 統(tǒng)計分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 細(xì)胞活性
        3.3.2 二維凝膠電泳和蛋白質(zhì)鑒定
        3.3.3 差異蛋白質(zhì)的功能分析
        3.3.4 Western blot
        3.3.5 RT-PCR
    3.4 討論
    3.5 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第四章 A549細(xì)胞及其蛋白質(zhì)組對外源鋅刺激的動態(tài)響應(yīng)
    摘要
    4.1 前言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 實驗材料和試劑
        4.2.2 實驗方法
            4.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            4.2.2.2 外源鋅對細(xì)胞的壓力
            4.2.2.3 細(xì)胞活性分析
            4.2.2.4 蛋白質(zhì)樣品的制備
            4.2.2.5 二維凝膠電泳和圖像分析
            4.2.2.6 蛋白質(zhì)鑒定
            4.2.2.7 Western blot
            4.2.2.8 鋅含量的測定
2+的共聚焦成像'>            4.2.2.9 細(xì)胞內(nèi)自由Zn²⁺的共聚焦成像
            4.2.2.10 統(tǒng)計分析
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 細(xì)胞活性
        4.3.2 鋅響應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式
        4.3.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定和功能分組
        4.3.4 蛋白質(zhì)HSP90α和hnRNPA1的表達(dá)模式
        4.3.5 差異蛋白質(zhì)濃度的測定
        4.3.6 差異Zn含量的測定
2+的觀測'>        4.3.7 細(xì)胞內(nèi)自由Zn²⁺的觀測
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第五章 A549細(xì)胞及其蛋白質(zhì)組對外源鎘刺激的動態(tài)響應(yīng)
    摘要
    5.1 前言
    5.2 實驗部分
        5.2.1 實驗材料和試劑
        5.2.2 實驗方法
            5.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            5.2.2.2 外源鎘對細(xì)胞的壓力
            5.2.2.3 細(xì)胞活性分析
            5.2.2.4 蛋白質(zhì)樣品的制備
            5.2.2.5 二維凝膠電泳和圖像分析
            5.2.2.6 蛋白質(zhì)鑒定
            5.2.2.7 Western Blot
            5.2.2.8 Cd、Zn、Cu、Co、Mn含量的測定
            5.2.2.9 RT-PCR
            5.2.2.10 統(tǒng)計分析
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 細(xì)胞活性
        5.3.2 鎘響應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式
        5.3.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定和功能分組
        5.3.4 差異蛋白質(zhì)濃度的測定
        5.3.5 蛋白質(zhì)HSP90α和hnRNPA1的表達(dá)模式
        5.3.6 差異鎘含量和必需金屬含量的測定
        5.3.7 MT-1和ZIP-8的差異表達(dá)
    5.4 討論
    5.5 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
結(jié)論
致謝
附錄A
附錄B

【參考文獻(xiàn)】

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5 杜鵬,馮偉華,郭俊生;蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)研究進(jìn)展[J];衛(wèi)生研究;2005年02期

6 于昱;王福O

本文編號：2833400