本文關(guān)鍵詞：創(chuàng)建快速進化策略研究鹵醇脫鹵酶碳末端功能，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鹵醇脫鹵酶,是一類存在于微生物降解有機鹵化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一,它不僅可以通過分子內(nèi)親核取代機制,催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化生成環(huán)氧化物和鹵化氫,還能在一系列親核試劑N3-、CN-和NO2-等介導(dǎo)下,高效高選擇地催化其逆反應(yīng)-環(huán)氧化物的開環(huán)反應(yīng),可以用來合成光學(xué)純的環(huán)氧化物以及β-取代醇等一系列高價值手性藥物中間體。因此,該酶具有十分重要的工業(yè)應(yīng)用前景。通過對目前研究較為廣泛的三類鹵醇脫鹵酶進行氨基酸序列同源性比對分析,我們發(fā)現(xiàn)來源于放射形土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium radiobacter AD1)中的鹵醇脫鹵酶(Hhe C),在其碳末端與另兩類鹵醇脫鹵酶存在著顯著的序列特征差異,即前者擁有長于另兩類酶約10個氨基酸的碳末端區(qū)域。相關(guān)研究表明,這段看似冗長的碳末端區(qū)域,對鹵醇脫鹵酶行使催化功能具有十分重要的作用,但對其具體的調(diào)控機制還缺乏深入地研究。為了更高效地研究碳末端的具體功能,本論文在迭代式飽和突變策略(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM)的基礎(chǔ)上,創(chuàng)建了兩種多位點快速進化策略。通過運用相關(guān)策略,系統(tǒng)地研究和揭示了鹵醇脫鹵酶碳末端的具體功能以及相應(yīng)的調(diào)控機制。具體研究內(nèi)容如下:(1)使用定點缺失突變技術(shù),逐一研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個氨基酸位點在酶催化反應(yīng)過程中的作用。對所獲得的10個碳末端氨基酸缺失突變體Δ1~Δ10,進行了表達(dá)純化和功能檢測。研究發(fā)現(xiàn):碳末端氨基酸的缺失,對鹵醇脫鹵酶的催化活性有相當(dāng)顯著的負(fù)效應(yīng),其中缺失突變體Δ7~Δ10幾乎完全喪失了催化活性。此外,碳末端氨基酸缺失后,還對酶的熱穩(wěn)定性具有十分顯著的負(fù)效應(yīng)。這些結(jié)果表明,該碳末端區(qū)域?qū)u醇脫鹵酶行使催化功能是必不可少的。(2)使用單點飽和突變技術(shù),系統(tǒng)地研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個氨基酸位點在酶催化反應(yīng)過程中的具體功能及調(diào)控機制。通過基于酶催化活性和熱穩(wěn)定性的文庫篩選,獲得了20個單點優(yōu)勢突變體,并對其進行表達(dá)純化和功能檢測。研究發(fā)現(xiàn):碳末端關(guān)鍵氨基酸位點249和252~254發(fā)生突變后,對鹵醇脫鹵酶的催化活性和熱穩(wěn)定性分別具有十分明顯地增強作用,證實了碳末端區(qū)域?qū)Υ呋钚院蜔岱�(wěn)定性均具有一定的調(diào)控功能。其中,碳末端關(guān)鍵氨基酸位點253和254,被證實能夠在不影響鹵醇脫鹵酶催化活性情形下,獨立地調(diào)控酶的熱穩(wěn)定性。同源建模分析發(fā)現(xiàn),優(yōu)勢突變體P253D和P253N,在氨基酸位點253和254之間增加了兩個氫鍵,能夠較好地穩(wěn)定整個碳末端區(qū)域的構(gòu)象,使得它們的熱穩(wěn)定性明顯改善。相關(guān)結(jié)果表明:碳末端區(qū)域內(nèi)氨基酸之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò),對其維持和調(diào)控鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性有著不可替代的作用。(3)創(chuàng)建高效的多位點快速進化策略,用于后續(xù)進一步研究和調(diào)控鹵醇脫鹵酶碳末端功能。首先,在ISM策略的基礎(chǔ)上,結(jié)合簡并密碼子設(shè)計工具DC-Analyzer,創(chuàng)建了非連續(xù)多位點快速進化策略,并成功用于增強鹵醇脫鹵酶的催化活性實例中。在對5個氨基酸位點的改造研究中,通過篩選約900個單克隆,獲得了催化活性較野生型提高9.3倍的高效突變體。但是,該策略用于含有多個連續(xù)或者相鄰位點的改造研究時,基于DC-Analyzer所設(shè)計的引物數(shù)目會大大增加。隨后,針對DC-Analyzer的應(yīng)用局限,成功地開發(fā)了適用于連讀多位點突變重組的簡并密碼子工具MDC-Analyzer。在此基礎(chǔ)上,創(chuàng)建了連續(xù)多位點快速進化策略,并成功運用于提高鹵醇脫鹵酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性實例中。在對6個和7個氨基酸位點的改造研究中,通過篩選1,151和384個單克隆,分別獲得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍熱失活半衰期的高效突變體。這些結(jié)果表明,本論文所創(chuàng)建的快速進化策略,能夠高效便捷地用于快速提高生物催化劑的催化特性。(4)運用所創(chuàng)建的快速進化策略,研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域關(guān)鍵氨基酸位點245,249,252,253和254的重組效應(yīng),進一步地調(diào)控和改善酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性。首先,使用非連續(xù)多位點快速進化策略,研究碳末端區(qū)域關(guān)鍵氨基酸位點245、249和252的重組效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),這3個氨基酸位點對酶的催化活性和熱穩(wěn)定性都有相當(dāng)明顯的加和效應(yīng),并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶5.0倍催化活性以及3.1倍熱失活半衰期的高效突變體DL10。隨后,運用連續(xù)多位點快速進化策略,在DL10的基礎(chǔ)上,進一步研究關(guān)鍵氨基酸位點253和254的重組效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),這2個氨基酸位點發(fā)生突變后,能夠在不影響DL10催化活性的前提下,獨立地調(diào)控酶的熱穩(wěn)定性,并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶4.0倍催化活性以及17.8倍熱失活半衰期的高效突變體PX14。可見,碳末端氨基酸調(diào)控鹵醇脫鹵酶的催化活性和熱穩(wěn)定性具有可疊加性。綜上所述,本論文選取來源于放射形土壤農(nóng)桿菌中的鹵醇脫鹵酶碳末端作為研究模型,系統(tǒng)地研究了該碳末端區(qū)域在鹵醇脫鹵酶行使催化反應(yīng)過程中的具體功能,揭示了其對酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性的調(diào)控機制。運用所創(chuàng)建的多位點快速進化策略,成功地篩選獲得了多個催化活性和熱穩(wěn)定性得以同時增強的高效突變體,這將有助于推動鹵醇脫鹵酶的理論研究和實際工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：鹵醇脫鹵酶 碳末端功能 單點飽和突變 多位點重組 快速進化策略
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 緒論14-22
• 1.1 鹵醇脫鹵酶的概述14-18
• 1.1.1 鹵醇脫鹵酶的簡介14
• 1.1.2 鹵醇脫鹵酶的分類14-15
• 1.1.3 鹵醇脫鹵酶的催化機理15-16
• 1.1.4 鹵醇脫鹵酶的應(yīng)用研究16-18
• 1.1.4.1 鹵醇脫鹵酶脫鹵反應(yīng)的應(yīng)用研究16
• 1.1.4.2 鹵醇脫鹵酶開環(huán)反應(yīng)的應(yīng)用研究16-17
• 1.1.4.3 鹵醇脫鹵酶工業(yè)應(yīng)用的拓展研究17-18
• 1.2 酶進化策略概述18-20
• 1.2.1 理性進化策略概述18
• 1.2.2 非理性進化策略概述18-19
• 1.2.3 半理性進化策略概述19-20
• 1.3 本論文的主要內(nèi)容20
• 1.4 本研究意義和目的20-21
• 1.5 本論文的結(jié)構(gòu)安排21-22
• 第二章 實驗材料和方法22-34
• 2.1 實驗材料22
• 2.2 實驗試劑22
• 2.3 溶液配制22-25
• 2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗溶液配制22
• 2.3.2 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備實驗溶液配制22-23
• 2.3.3 突變體文庫比色篩選實驗溶液配制23
• 2.3.4 突變體表達(dá)及純化實驗溶液配制23
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗溶液配制23-24
• 2.3.6 酶活性測定實驗溶液配制24-25
• 2.4 實驗方法25-34
• 2.4.1 鹵醇脫鹵酶突變體基因擴增25-27
• 2.4.1.1 PCR擴增鹵醇脫鹵酶突變體基因25-26
• 2.4.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果26
• 2.4.1.3 瓊脂糖凝膠回收PCR擴增片段26
• 2.4.1.4 限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物26-27
• 2.4.2 鹵醇脫鹵酶突變體文庫構(gòu)建及篩選27-30
• 2.4.2.1 鹵醇脫鹵酶突變體文庫構(gòu)建27-28
• 2.4.2.2 鹵醇脫鹵酶突變體文庫篩選28-29
• 2.4.2.3 鹵醇脫鹵酶突變體質(zhì)粒提取29-30
• 2.4.3 鹵醇脫鹵酶突變體誘導(dǎo)表達(dá)及純化30-32
• 2.4.3.1 鹵醇脫鹵酶突變體誘導(dǎo)表達(dá)30
• 2.4.3.2 陰離子交換層析純化酶蛋白30-31
• 2.4.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純化效果31-32
• 2.4.3.4 紫外法測定純化酶蛋白濃度32
• 2.4.4 鹵醇脫鹵酶催化活性和熱穩(wěn)定性測定32-34
• 第三章 鹵醇脫鹵酶碳末端功能研究34-52
• 3.1 概述34
• 3.2 實驗材料和方法34-35
• 3.3 實驗結(jié)果和分析35-49
• 3.3.1 鹵醇脫鹵酶碳末端功能研究區(qū)域的選擇35-36
• 3.3.2 碳末端缺失突變體功能研究36-39
• 3.3.2.1 碳末端缺失突變體構(gòu)建36-38
• 3.3.2.2 碳末端缺失突變體表達(dá)純化及功能檢測38-39
• 3.3.3 碳末端單點飽和突變研究39-49
• 3.3.3.1 單點飽和突變體文庫構(gòu)建39-41
• 3.3.3.2 單點飽和突變體文庫篩選41-42
• 3.3.3.3 優(yōu)勢突變體表達(dá)純化及功能檢測42-44
• 3.3.3.4 優(yōu)勢突變體結(jié)構(gòu)與計算分析44-49
• 3.4 討論49-51
• 3.5 小結(jié)51-52
• 第四章 創(chuàng)建非連續(xù)多位點快速進化策略52-66
• 4.1 概述52
• 4.2 實驗材料和方法52-53
• 4.3 實驗結(jié)果和分析53-62
• 4.3.1 常見的多位點重組進化策略比較53-54
• 4.3.2 創(chuàng)建非連續(xù)多位點快速進化策略54-55
• 4.3.3 非連續(xù)多位點快速進化策略運用實例55-61
• 4.3.3.1 多位點快速進化改造的區(qū)域選擇55
• 4.3.3.2 單點飽和突變體文庫構(gòu)建及篩選55-58
• 4.3.3.3 多位點快速重組引物設(shè)計58
• 4.3.3.4 多位點重組突變體文庫構(gòu)建及篩選58-59
• 4.3.3.5 多位點重組突變體表達(dá)純化及酶活檢測59-61
• 4.3.4 迭代式飽和突變策略實例對比研究61-62
• 4.3.4.1 迭代式飽和突變策略的實施流程61
• 4.3.4.2 迭代式飽和突變策略的實例對比61-62
• 4.4 討論62-65
• 4.5 小結(jié)65-66
• 第五章 創(chuàng)建連續(xù)多位點快速進化策略66-82
• 5.1 概述66
• 5.2 實驗材料和方法66-67
• 5.3 實驗結(jié)果和分析67-78
• 5.3.1 多位點重組簡并密碼子工具的設(shè)計67-69
• 5.3.2 創(chuàng)建連續(xù)多位點快速進化策略69-70
• 5.3.3 連續(xù)多位點快速進化策略運用實例一70-75
• 5.3.3.1 多位點快速進化改造的區(qū)域選擇70
• 5.3.3.2 單點飽和突變體文庫構(gòu)建及篩選70-72
• 5.3.3.3 多位點快速重組突變引物設(shè)計72-73
• 5.3.3.4 多位點重組突變體文庫構(gòu)建及篩選73-74
• 5.3.3.5 多位點重組突變體表達(dá)純化及酶活檢測74-75
• 5.3.4 連續(xù)多位點快速進化策略運用實例二75-78
• 5.3.4.1 多位點快速進化改造的區(qū)域選擇75-77
• 5.3.4.2 多位點快速重組引物設(shè)計77
• 5.3.4.3 多位點重組突變體文庫構(gòu)建及篩選77-78
• 5.3.4.4 多位點重組突變體表達(dá)純化及功能檢測78
• 5.4 討論78-81
• 5.5 小結(jié)81-82
• 第六章 鹵醇脫鹵酶碳末端多位點重組研究82-92
• 6.1 概述82
• 6.2 實驗材料和方法82-83
• 6.3 實驗結(jié)果和分析83-89
• 6.3.1 碳末端非連續(xù)多位點快速進化研究83-85
• 6.3.1.1 非連續(xù)多位點快速重組引物設(shè)計83-84
• 6.3.1.2 非連續(xù)多位點重組突變體文庫構(gòu)建及篩選84
• 6.3.1.3 非連續(xù)多位點重組突變體表達(dá)純化及功能檢測84-85
• 6.3.2 碳末端連續(xù)多位點快速進化研究85-87
• 6.3.2.1 連續(xù)多位點快速重組引物設(shè)計85
• 6.3.2.2 連續(xù)多位點重組突變體文庫構(gòu)建及篩選85-86
• 6.3.2.3 連續(xù)多位點重組突變體表達(dá)純化及功能檢測86-87
• 6.3.3 碳末端多位點重組突變體結(jié)構(gòu)分析87-89
• 6.4 討論89-90
• 6.5 小結(jié)90-92
• 第七章 結(jié)論92-94
• 7.1 本論文的主要結(jié)論92-93
• 7.2 下一步工作的展望93-94
• 致謝94-95
• 參考文獻95-108
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的成果108-109

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本文編號：283239