本文關(guān)鍵詞：創(chuàng)建快速進(jìn)化策略研究鹵醇脫鹵酶碳末端功能，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鹵醇脫鹵酶,是一類存在于微生物降解有機(jī)鹵化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一,它不僅可以通過(guò)分子內(nèi)親核取代機(jī)制,催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化生成環(huán)氧化物和鹵化氫,還能在一系列親核試劑N3-、CN-和NO2-等介導(dǎo)下,高效高選擇地催化其逆反應(yīng)-環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)反應(yīng),可以用來(lái)合成光學(xué)純的環(huán)氧化物以及β-取代醇等一系列高價(jià)值手性藥物中間體。因此,該酶具有十分重要的工業(yè)應(yīng)用前景。通過(guò)對(duì)目前研究較為廣泛的三類鹵醇脫鹵酶進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)分析,我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源于放射形土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium radiobacter AD1)中的鹵醇脫鹵酶(Hhe C),在其碳末端與另兩類鹵醇脫鹵酶存在著顯著的序列特征差異,即前者擁有長(zhǎng)于另兩類酶約10個(gè)氨基酸的碳末端區(qū)域。相關(guān)研究表明,這段看似冗長(zhǎng)的碳末端區(qū)域,對(duì)鹵醇脫鹵酶行使催化功能具有十分重要的作用,但對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制還缺乏深入地研究。為了更高效地研究碳末端的具體功能,本論文在迭代式飽和突變策略(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM)的基礎(chǔ)上,創(chuàng)建了兩種多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略。通過(guò)運(yùn)用相關(guān)策略,系統(tǒng)地研究和揭示了鹵醇脫鹵酶碳末端的具體功能以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)使用定點(diǎn)缺失突變技術(shù),逐一研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個(gè)氨基酸位點(diǎn)在酶催化反應(yīng)過(guò)程中的作用。對(duì)所獲得的10個(gè)碳末端氨基酸缺失突變體Δ1~Δ10,進(jìn)行了表達(dá)純化和功能檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn):碳末端氨基酸的缺失,對(duì)鹵醇脫鹵酶的催化活性有相當(dāng)顯著的負(fù)效應(yīng),其中缺失突變體Δ7~Δ10幾乎完全喪失了催化活性。此外,碳末端氨基酸缺失后,還對(duì)酶的熱穩(wěn)定性具有十分顯著的負(fù)效應(yīng)。這些結(jié)果表明,該碳末端區(qū)域?qū)u醇脫鹵酶行使催化功能是必不可少的。(2)使用單點(diǎn)飽和突變技術(shù),系統(tǒng)地研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個(gè)氨基酸位點(diǎn)在酶催化反應(yīng)過(guò)程中的具體功能及調(diào)控機(jī)制。通過(guò)基于酶催化活性和熱穩(wěn)定性的文庫(kù)篩選,獲得了20個(gè)單點(diǎn)優(yōu)勢(shì)突變體,并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)純化和功能檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn):碳末端關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)249和252~254發(fā)生突變后,對(duì)鹵醇脫鹵酶的催化活性和熱穩(wěn)定性分別具有十分明顯地增強(qiáng)作用,證實(shí)了碳末端區(qū)域?qū)Υ呋钚院蜔岱�(wěn)定性均具有一定的調(diào)控功能。其中,碳末端關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)253和254,被證實(shí)能夠在不影響鹵醇脫鹵酶催化活性情形下,獨(dú)立地調(diào)控酶的熱穩(wěn)定性。同源建模分析發(fā)現(xiàn),優(yōu)勢(shì)突變體P253D和P253N,在氨基酸位點(diǎn)253和254之間增加了兩個(gè)氫鍵,能夠較好地穩(wěn)定整個(gè)碳末端區(qū)域的構(gòu)象,使得它們的熱穩(wěn)定性明顯改善。相關(guān)結(jié)果表明:碳末端區(qū)域內(nèi)氨基酸之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò),對(duì)其維持和調(diào)控鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性有著不可替代的作用。(3)創(chuàng)建高效的多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略,用于后續(xù)進(jìn)一步研究和調(diào)控鹵醇脫鹵酶碳末端功能。首先,在ISM策略的基礎(chǔ)上,結(jié)合簡(jiǎn)并密碼子設(shè)計(jì)工具DC-Analyzer,創(chuàng)建了非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略,并成功用于增強(qiáng)鹵醇脫鹵酶的催化活性實(shí)例中。在對(duì)5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改造研究中,通過(guò)篩選約900個(gè)單克隆,獲得了催化活性較野生型提高9.3倍的高效突變體。但是,該策略用于含有多個(gè)連續(xù)或者相鄰位點(diǎn)的改造研究時(shí),基于DC-Analyzer所設(shè)計(jì)的引物數(shù)目會(huì)大大增加。隨后,針對(duì)DC-Analyzer的應(yīng)用局限,成功地開(kāi)發(fā)了適用于連讀多位點(diǎn)突變重組的簡(jiǎn)并密碼子工具M(jìn)DC-Analyzer。在此基礎(chǔ)上,創(chuàng)建了連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略,并成功運(yùn)用于提高鹵醇脫鹵酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性實(shí)例中。在對(duì)6個(gè)和7個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改造研究中,通過(guò)篩選1,151和384個(gè)單克隆,分別獲得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍熱失活半衰期的高效突變體。這些結(jié)果表明,本論文所創(chuàng)建的快速進(jìn)化策略,能夠高效便捷地用于快速提高生物催化劑的催化特性。(4)運(yùn)用所創(chuàng)建的快速進(jìn)化策略,研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)245,249,252,253和254的重組效應(yīng),進(jìn)一步地調(diào)控和改善酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性。首先,使用非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略,研究碳末端區(qū)域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)245、249和252的重組效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),這3個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)酶的催化活性和熱穩(wěn)定性都有相當(dāng)明顯的加和效應(yīng),并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶5.0倍催化活性以及3.1倍熱失活半衰期的高效突變體DL10。隨后,運(yùn)用連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略,在DL10的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)253和254的重組效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),這2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變后,能夠在不影響DL10催化活性的前提下,獨(dú)立地調(diào)控酶的熱穩(wěn)定性,并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶4.0倍催化活性以及17.8倍熱失活半衰期的高效突變體PX14。可見(jiàn),碳末端氨基酸調(diào)控鹵醇脫鹵酶的催化活性和熱穩(wěn)定性具有可疊加性。綜上所述,本論文選取來(lái)源于放射形土壤農(nóng)桿菌中的鹵醇脫鹵酶碳末端作為研究模型,系統(tǒng)地研究了該碳末端區(qū)域在鹵醇脫鹵酶行使催化反應(yīng)過(guò)程中的具體功能,揭示了其對(duì)酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。運(yùn)用所創(chuàng)建的多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略,成功地篩選獲得了多個(gè)催化活性和熱穩(wěn)定性得以同時(shí)增強(qiáng)的高效突變體,這將有助于推動(dòng)鹵醇脫鹵酶的理論研究和實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：鹵醇脫鹵酶 碳末端功能 單點(diǎn)飽和突變 多位點(diǎn)重組 快速進(jìn)化策略
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q55
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 緒論14-22
• 1.1 鹵醇脫鹵酶的概述14-18
• 1.1.1 鹵醇脫鹵酶的簡(jiǎn)介14
• 1.1.2 鹵醇脫鹵酶的分類14-15
• 1.1.3 鹵醇脫鹵酶的催化機(jī)理15-16
• 1.1.4 鹵醇脫鹵酶的應(yīng)用研究16-18
• 1.1.4.1 鹵醇脫鹵酶脫鹵反應(yīng)的應(yīng)用研究16
• 1.1.4.2 鹵醇脫鹵酶開(kāi)環(huán)反應(yīng)的應(yīng)用研究16-17
• 1.1.4.3 鹵醇脫鹵酶工業(yè)應(yīng)用的拓展研究17-18
• 1.2 酶進(jìn)化策略概述18-20
• 1.2.1 理性進(jìn)化策略概述18
• 1.2.2 非理性進(jìn)化策略概述18-19
• 1.2.3 半理性進(jìn)化策略概述19-20
• 1.3 本論文的主要內(nèi)容20
• 1.4 本研究意義和目的20-21
• 1.5 本論文的結(jié)構(gòu)安排21-22
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法22-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑22
• 2.3 溶液配制22-25
• 2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)溶液配制22
• 2.3.2 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)溶液配制22-23
• 2.3.3 突變體文庫(kù)比色篩選實(shí)驗(yàn)溶液配制23
• 2.3.4 突變體表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)溶液配制23
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)溶液配制23-24
• 2.3.6 酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)溶液配制24-25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法25-34
• 2.4.1 鹵醇脫鹵酶突變體基因擴(kuò)增25-27
• 2.4.1.1 PCR擴(kuò)增鹵醇脫鹵酶突變體基因25-26
• 2.4.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果26
• 2.4.1.3 瓊脂糖凝膠回收PCR擴(kuò)增片段26
• 2.4.1.4 限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物26-27
• 2.4.2 鹵醇脫鹵酶突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選27-30
• 2.4.2.1 鹵醇脫鹵酶突變體文庫(kù)構(gòu)建27-28
• 2.4.2.2 鹵醇脫鹵酶突變體文庫(kù)篩選28-29
• 2.4.2.3 鹵醇脫鹵酶突變體質(zhì)粒提取29-30
• 2.4.3 鹵醇脫鹵酶突變體誘導(dǎo)表達(dá)及純化30-32
• 2.4.3.1 鹵醇脫鹵酶突變體誘導(dǎo)表達(dá)30
• 2.4.3.2 陰離子交換層析純化酶蛋白30-31
• 2.4.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)純化效果31-32
• 2.4.3.4 紫外法測(cè)定純化酶蛋白濃度32
• 2.4.4 鹵醇脫鹵酶催化活性和熱穩(wěn)定性測(cè)定32-34
• 第三章 鹵醇脫鹵酶碳末端功能研究34-52
• 3.1 概述34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法34-35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析35-49
• 3.3.1 鹵醇脫鹵酶碳末端功能研究區(qū)域的選擇35-36
• 3.3.2 碳末端缺失突變體功能研究36-39
• 3.3.2.1 碳末端缺失突變體構(gòu)建36-38
• 3.3.2.2 碳末端缺失突變體表達(dá)純化及功能檢測(cè)38-39
• 3.3.3 碳末端單點(diǎn)飽和突變研究39-49
• 3.3.3.1 單點(diǎn)飽和突變體文庫(kù)構(gòu)建39-41
• 3.3.3.2 單點(diǎn)飽和突變體文庫(kù)篩選41-42
• 3.3.3.3 優(yōu)勢(shì)突變體表達(dá)純化及功能檢測(cè)42-44
• 3.3.3.4 優(yōu)勢(shì)突變體結(jié)構(gòu)與計(jì)算分析44-49
• 3.4 討論49-51
• 3.5 小結(jié)51-52
• 第四章 創(chuàng)建非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略52-66
• 4.1 概述52
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法52-53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析53-62
• 4.3.1 常見(jiàn)的多位點(diǎn)重組進(jìn)化策略比較53-54
• 4.3.2 創(chuàng)建非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略54-55
• 4.3.3 非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略運(yùn)用實(shí)例55-61
• 4.3.3.1 多位點(diǎn)快速進(jìn)化改造的區(qū)域選擇55
• 4.3.3.2 單點(diǎn)飽和突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選55-58
• 4.3.3.3 多位點(diǎn)快速重組引物設(shè)計(jì)58
• 4.3.3.4 多位點(diǎn)重組突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選58-59
• 4.3.3.5 多位點(diǎn)重組突變體表達(dá)純化及酶活檢測(cè)59-61
• 4.3.4 迭代式飽和突變策略實(shí)例對(duì)比研究61-62
• 4.3.4.1 迭代式飽和突變策略的實(shí)施流程61
• 4.3.4.2 迭代式飽和突變策略的實(shí)例對(duì)比61-62
• 4.4 討論62-65
• 4.5 小結(jié)65-66
• 第五章 創(chuàng)建連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略66-82
• 5.1 概述66
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法66-67
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析67-78
• 5.3.1 多位點(diǎn)重組簡(jiǎn)并密碼子工具的設(shè)計(jì)67-69
• 5.3.2 創(chuàng)建連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略69-70
• 5.3.3 連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略運(yùn)用實(shí)例一70-75
• 5.3.3.1 多位點(diǎn)快速進(jìn)化改造的區(qū)域選擇70
• 5.3.3.2 單點(diǎn)飽和突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選70-72
• 5.3.3.3 多位點(diǎn)快速重組突變引物設(shè)計(jì)72-73
• 5.3.3.4 多位點(diǎn)重組突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選73-74
• 5.3.3.5 多位點(diǎn)重組突變體表達(dá)純化及酶活檢測(cè)74-75
• 5.3.4 連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略運(yùn)用實(shí)例二75-78
• 5.3.4.1 多位點(diǎn)快速進(jìn)化改造的區(qū)域選擇75-77
• 5.3.4.2 多位點(diǎn)快速重組引物設(shè)計(jì)77
• 5.3.4.3 多位點(diǎn)重組突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選77-78
• 5.3.4.4 多位點(diǎn)重組突變體表達(dá)純化及功能檢測(cè)78
• 5.4 討論78-81
• 5.5 小結(jié)81-82
• 第六章 鹵醇脫鹵酶碳末端多位點(diǎn)重組研究82-92
• 6.1 概述82
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法82-83
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析83-89
• 6.3.1 碳末端非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化研究83-85
• 6.3.1.1 非連續(xù)多位點(diǎn)快速重組引物設(shè)計(jì)83-84
• 6.3.1.2 非連續(xù)多位點(diǎn)重組突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選84
• 6.3.1.3 非連續(xù)多位點(diǎn)重組突變體表達(dá)純化及功能檢測(cè)84-85
• 6.3.2 碳末端連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化研究85-87
• 6.3.2.1 連續(xù)多位點(diǎn)快速重組引物設(shè)計(jì)85
• 6.3.2.2 連續(xù)多位點(diǎn)重組突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選85-86
• 6.3.2.3 連續(xù)多位點(diǎn)重組突變體表達(dá)純化及功能檢測(cè)86-87
• 6.3.3 碳末端多位點(diǎn)重組突變體結(jié)構(gòu)分析87-89
• 6.4 討論89-90
• 6.5 小結(jié)90-92
• 第七章 結(jié)論92-94
• 7.1 本論文的主要結(jié)論92-93
• 7.2 下一步工作的展望93-94
• 致謝94-95
• 參考文獻(xiàn)95-108
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的成果108-109

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本文編號(hào)：283239