本文關(guān)鍵詞：水稻PHR1家族基因?qū)α仔盘?hào)和磷平衡綜合調(diào)控的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：磷素(PhosphoRUs,P)是植物生長必需的營養(yǎng)元素,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也必不可少外部環(huán)境磷養(yǎng)分供應(yīng)不足會(huì)嚴(yán)重影響作物生長,從而導(dǎo)致減產(chǎn)。雖然土壤中磷含量很高,但土壤中磷的不易移動(dòng)性和低效性使得磷成為植物生長的限制因素,導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不得不大量施用磷肥,這不但增加了生產(chǎn)成本,還造成了環(huán)境污染。因此培育磷高效的農(nóng)作物才是保持農(nóng)業(yè)可續(xù)發(fā)展的重要途徑。PHR1(Phosphate StarVation Response 1)在植物磷信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作為中心調(diào)控因子,通過結(jié)合P1BS基序(PHR1 binding site,P1BS)調(diào)控植物磷信號(hào)與磷平衡。PHR1在不同物種中如何調(diào)控磷信號(hào)與平衡已有大量研究,但水稻中PHR1家族多基因在磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中如何協(xié)同調(diào)控仍不清楚。因此本論文旨在深入探討水稻PHR1家族基因?qū)α仔盘?hào)和磷平衡的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。通過同源比對(duì)分析,本研究在水稻中分析了PHR1的同源基因OsPHR3,其屬于MYB-CC家族,位于水稻第2號(hào)染色體(2079149-2075496),cDNA全長1404bp,編碼468個(gè)氨基酸,由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。同時(shí),本研究購買獲得了OsPHR3的Tos-17插入突變體(NE300901021A),命名為phr3。利用qRT-PCR和GUS組織切片技術(shù),本研究分析了水稻中三個(gè)磷信號(hào)調(diào)控因子OsPHR1,OSPHR2與OsPHR3(簡寫為PHR1-3)在不同時(shí)期的組織表達(dá)特性。qRT-PCR分析表明PHR1-3在水稻整個(gè)生長期均表達(dá)；葉中OsPHR1和OsPHR2在不同時(shí)期的表達(dá)差異并不顯著；OsPHR3的表達(dá)在抽穗期顯著誘導(dǎo)。GUS葉片橫切表明OsPHR1主要位于維管組織,OsPHR3主要位于維管組織與葉肉細(xì)胞,而OsPHR2的表達(dá)部位覆蓋了OsPHR1和OsPHR3的所有表達(dá)部位。由GUS組織切片可知,PHR1-3可能存在功能冗余。因此,為了進(jìn)一步分析PHR1-3的功能,本研究發(fā)展了PHR1-3的相關(guān)突變體；單突：phr1、phr2、phr3；雙突phr1/2、phr1/3和phr2/3；三突：phr1/2/3。qRT-PCR分析結(jié)果可知,phrl、phr2與phr3突變后對(duì)OsPHR2下游磷饑餓響應(yīng)基因OsIPS1、OsPT2和OsmiR827都有不同程度抑制。正常供磷(200μM Pi)條件下,phr2、phr1/2、phr2/3及phr1/2/3生長受到不同程度抑制；phr1、phr2、phr3的有效磷含量與野生型相比無顯著差異,而phr1/2/3的有效磷含量顯著降低。缺磷(0μMPi)條件下,突變體phr1、phr2、 phr3、phr1/2、phr1/3、phr2/3和phr1/2/3的根毛伸長與野生型相比受到抑制。這些結(jié)果說明PHR1-3三個(gè)基因存在功能冗余及加性。通過對(duì)PHR1-3相關(guān)突變體進(jìn)行基因芯片分析發(fā)現(xiàn),在phrl突變體中,有78基因被誘導(dǎo),158個(gè)基因受到抑制；在phr3突變體中,有169個(gè)基因被誘導(dǎo),155個(gè)基因受到抑制。但在三突phr1/2/3中,有2115個(gè)基因被誘導(dǎo),2224個(gè)基因受到抑制。而且,在phrl與phr3突變體中,均受到誘導(dǎo)的基因只有33個(gè),受到抑制的有32個(gè)；由此說明：OsPHR1、OsPHR2與OsPHR3在下游基因調(diào)控方面存在顯著的不同。另外,本研究通過PHR1-3的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系分析了其對(duì)水稻磷信號(hào)與磷平衡的影響。正常供磷(200μM Pi)條件下OsPHR3的增強(qiáng)表達(dá)能引起地上部有效磷增加,有效磷含量高于OsPHR1-Ov1,但低于OsPHR2-Ov-1。而在低磷(10μM Pi)培養(yǎng)時(shí)葉片有效磷含量與野生型無顯著差異,說明OsPHR3參與水稻的磷饑餓響應(yīng)及磷平衡。正常供磷條件下,OsPHR1、OsPHR2及OsPHR3的增強(qiáng)表達(dá)能夠誘導(dǎo)缺磷信號(hào),促進(jìn)根毛的伸長；其中OsPHR2根毛的誘導(dǎo)程度比OsPHR1和OsPHR3顯著,這一結(jié)果表明三個(gè)PHR蛋白的轉(zhuǎn)錄能力存在差異。溶液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),在正常磷(200μM Pi)或低磷(10μM Pi)條件下,OsPHR3過表達(dá)并不會(huì)影響水稻的生長,田間實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果可知,在三個(gè)磷梯度實(shí)驗(yàn)中OsPHR3過表達(dá)株系的生物量及產(chǎn)量均比野生型要高,暗示OsPHR3對(duì)于培育耐低磷水稻新品種可能是一個(gè)重要候選基因。為此,本研究利用OsPHR3對(duì)長江中下游的高產(chǎn)品種秀水134(XS134)進(jìn)行了遺傳改良,結(jié)果同樣表明OsPHR3改良株系具有耐低磷的特性。為了分析OsPHR3過表達(dá)株系耐低磷的分子機(jī)制,本研究分析了PHR1-3對(duì)PHR1識(shí)別元件的親和力差異。利用酵母單雜(Yeast-one-hybridization)和凝膠阻滯分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)技術(shù),發(fā)現(xiàn)三個(gè)PHR對(duì)不同P1BS的親和力存在差異,其中OsPHR2對(duì)P1BS親和力最高,OsPHRl次之,OsPHR3最弱。PHR1-3的親和力競爭實(shí)驗(yàn)同樣說明OsPHR3對(duì)識(shí)別基序P1BS的親和力是最弱的。綜上所述,本研究揭示了三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OsPHR1、OsPHR2、OsPHR3對(duì)水稻磷信號(hào)和磷平衡的協(xié)同調(diào)控過程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)OsPHR3的增強(qiáng)表達(dá)能夠提高水稻的耐低磷特性,這為耐低磷作物的遺傳改良提供了新的途徑。
【關(guān)鍵詞】：磷 轉(zhuǎn)錄因子 水稻 低磷脅迫
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 致謝10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-16
• 縮略語表16-17
• 第1章 文獻(xiàn)綜述17-29
• 1.1 磷饑餓響應(yīng)的生理生化變化17-18
• 1.1.1 根形態(tài)變化17
• 1.1.2 有機(jī)酸及磷酸脂酶17-18
• 1.1.3 磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體18
• 1.1.4 菌根真菌18
• 1.1.5 體內(nèi)磷的再利用18
• 1.2 植物對(duì)缺磷信號(hào)的響應(yīng)18-22
• 1.2.1 局部磷信號(hào)19
• 1.2.2 系統(tǒng)磷信號(hào)19-22
• 1.3 Pi饑餓的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)及調(diào)控22-27
• 1.3.1 缺Pi時(shí)的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)23-24
• 1.3.2 缺磷響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控24
• 1.3.3 PHR1對(duì)Pi饑餓轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的重要作用24-25
• 1.3.4 OsPHR2對(duì)水稻磷平衡的調(diào)控25-26
• 1.3.5 Pi饑餓轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子26-27
• 1.4 本研究的目的及意義27-29
• 第2章 水稻低磷脅迫轉(zhuǎn)錄因子OsPHR3基因的生物信息學(xué)分析29-33
• 2.1 方法29
• 2.1.1 OsPHR3基因序列分析29
• 2.1.2 OsPHR3與MYB-CC家族蛋白聯(lián)配分析29
• 2.1.3 OsPHR3與MYB-CC家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析29
• 2.2 結(jié)果與分析29-31
• 2.2.1 OsPHR3基因結(jié)構(gòu)分析29-30
• 2.2.2 OsPHR3與MYB-CC家族蛋白聯(lián)配及進(jìn)化樹分析30-31
• 2.3 小結(jié)31-33
• 第3章 水稻OsPHR1-3基因表達(dá)及組織特異性分析33-43
• 3.1 材料33
• 3.2 方法33-38
• 3.2.1 水稻溶液培養(yǎng)33-34
• 3.2.2 水稻總RNA提取34
• 3.2.3 cDNA第一鏈合成34
• 3.2.4 水稻基因組DNA提取34
• 3.2.5 GUS表達(dá)載體的構(gòu)建34-35
• 3.2.6 農(nóng)桿菌侵染法介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化35-36
• 3.2.7 GUS染色及顯微鏡觀察36
• 3.2.8 不同生長時(shí)期OsPHR1-3基因的表達(dá)36-37
• 3.2.9 OsPHR3亞細(xì)胞定位分析37-38
• 3.3 結(jié)果與分析38-41
• 3.3.1 OsPHR1-3組織特異性分析38-40
• 3.3.2 水稻不同生長時(shí)期OsPHR1-3基因表達(dá)水平分析40-41
• 3.3.3 OsPHR3亞細(xì)胞定位41
• 3.4 小結(jié)41-43
• 第4章 phr1、phr2及phr3突變體植株分析43-61
• 4.1 材料43
• 4.2 方法43-47
• 4.2.1 OsPHR1 CRISPR-Cas9載體構(gòu)建43-44
• 4.2.2 phr3 Tos17插入突變體鑒定44
• 4.2.3 phr1/2,phr1/3,phr2/3雙突材料發(fā)展及鑒定44
• 4.2.4 phr1/2/3三突材料發(fā)展及鑒定44
• 4.2.5 phr突變體對(duì)水稻根毛的影響44
• 4.2.6 phr突變體表型分析44-45
• 4.2.7 phr突變體有效磷含量測定45
• 4.2.8 phr突變體中磷信號(hào)基因的表達(dá)水平分析45
• 4.2.9 phr突變體差異基因表達(dá)譜分析45-47
• 4.3 結(jié)果與分析47-59
• 4.3.1 phr1突變體鑒定47-48
• 4.3.2 phr3 Tos17插入突變體鑒定48-49
• 4.3.3 phr1/2,phr1/3,phr2/3雙突鑒定49-50
• 4.3.4 phr1/2/3三突鑒定50-51
• 4.3.5 phr突變體根毛表型分析51-52
• 4.3.6 phr突變體表型分析52-55
• 4.3.7 phr突變體有效磷含量測定55
• 4.3.8 phr突變體中磷信號(hào)基因的表達(dá)水平分析55-58
• 4.3.9 phr突變體差異基因表達(dá)譜分析58-59
• 4.4 小結(jié)59-61
• 第5章 OsPHR1-3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株分析61-73
• 5.1 材料61
• 5.2 方法61-62
• 5.2.1 OsPHR1-3過表達(dá)對(duì)根毛的影響61
• 5.2.2 OsPHR1-3過表達(dá)株系表型分析61
• 5.2.3 PHR1-3過表達(dá)株系中缺磷響應(yīng)基因的表達(dá)分析61
• 5.2.4 OsPHR3(ov)田間表型分析61-62
• 5.2.5 OsPHR3(ov)無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因株系田間表型分析62
• 5.2.6 PHR2及PHR3蛋白水平檢測62
• 5.3 結(jié)果與分析62-72
• 5.3.1 OsPHR1-3過表達(dá)對(duì)根毛的影響62-63
• 5.3.2 OsPHR1-3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系表型分析63-66
• 5.3.3 PHR1-3過表達(dá)株系中缺磷響應(yīng)基因的表達(dá)分析66
• 5.3.4 OsPHR3(ov)田間表型分析66-67
• 5.3.5 OsPHR3無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因株系田間實(shí)驗(yàn)67-71
• 5.3.6 PHR2及PHR3蛋白水平分析71-72
• 5.4 小結(jié)72-73
• 第6章 順式作用元件P1BS對(duì)不同PHR親和力的調(diào)控73-81
• 6.1 材料73
• 6.1.1 菌株73
• 6.1.2 載體73
• 6.2 方法73-77
• 6.2.1 酵母單雜73-75
• 6.2.2 凝膠阻滯75-77
• 6.3 結(jié)果與分析77-79
• 6.4 小結(jié)79-81
• 第7章 討論與展望81-85
• 7.1 OsPHR1,OsPHR2和OsPHR3功能冗余81-82
• 7.2 OsPHR1,OsPHR2和OsPHR3功能多樣性82-83
• 7.3 水稻OsPHR3過表達(dá)能耐低磷83-85
• 參考文獻(xiàn)85-97
• 附錄97-101
• 附錄1 引物總匯97-101
• 作者簡歷101

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Characterization of the promoter of phosphate transporter TaPHT1.2 differentially expressed in wheat varieties[J];遺傳學(xué)報(bào);2009年08期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周潔;水稻低磷脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsPHR1和OsPHR2的功能研究[D];浙江大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：水稻PHR1家族基因?qū)α仔盘?hào)和磷平衡綜合調(diào)控的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：283260