本文關(guān)鍵詞：擬南芥雙特異性磷酸酶IBR5在溫度依賴的防衛(wèi)反應(yīng)中的功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物對(duì)病原菌的響應(yīng)在進(jìn)化過程中已經(jīng)形成一套復(fù)雜而有效的機(jī)制,這其中,抗病(Resistance, R)蛋白通過識(shí)別不同病原菌效應(yīng)因子,對(duì)激活植物ETI (Effector-Triggered Immunity)進(jìn)程具有重要作用。低溫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要的環(huán)境因素,作為非生物脅迫,低溫常常影響植物對(duì)于病原菌的響應(yīng)。一系列R蛋白可以在低溫的狀態(tài)下被激活,包括TIR-NB-LRR (Toll and Interleukin 1 Receptor-Nucleotide Binding-Leucine-Rich Repeat)類R蛋白SNC1及CHS2/RPP4。它們?cè)谡Ｇ闆r處于非激活狀態(tài),當(dāng)其NB結(jié)構(gòu)域發(fā)生點(diǎn)突變后,突變形式的R蛋白在低溫狀態(tài)下可以被激活,使突變體在沒有病原菌入侵的情況下,仍然激活免疫反應(yīng)。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦袌?bào)道了一個(gè)冷敏感突變體chs3-1 (chilling sensitive 3), CHS3編碼一個(gè)攜帶LIM (Lin-11, Isl-1和Mec-3)結(jié)構(gòu)域的非典型TIR-NB-LRR類R蛋白。在LIM結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變導(dǎo)致非正常剪切,形成一段截?cái)嗟鞍�。功能獲得型突變體chs3-1在16℃具有免疫反應(yīng)激活的表型,具體表現(xiàn)為植株矮小,葉片皺縮,出現(xiàn)細(xì)胞死亡、水楊酸(Salicylic acid, SA)和過氧化氫積累,PR(Pathogenesis Related)基因表達(dá)上調(diào)。遺傳分析表明它的冷敏感表型依賴EDS1(Enhanced Disease Susceptibility 1)、SGTlb (Suppressor of the G2 allele of skp1)及RAR1 (Required for MLA12 Resistance 1)等R蛋白執(zhí)行功能所必需的組分。為了進(jìn)一步研究CHS3介導(dǎo)的溫度依賴的免疫反應(yīng)的分子機(jī)制,本論文對(duì)chs3-1進(jìn)行抑制子篩選,鑒定其中一個(gè)抑制子是ibr5-7 (indole-3-butyric acid response 5),該突變體能夠很大程度回復(fù)chs3-1低溫下激活的防衛(wèi)反應(yīng)。IBR5編碼一個(gè)預(yù)測(cè)的雙特異性磷酸酶。已有文獻(xiàn)報(bào)道缺失突變體ibr5對(duì)生長(zhǎng)素和ABA均不敏感,IBR5通過去磷酸化MPK12 (Mitogen-Activated Protein Kinase12),參與調(diào)控生長(zhǎng)素信號(hào),而其在ABA信號(hào)途徑的作用不依賴MPK12,目前IBR5在免疫反應(yīng)中的作用沒有報(bào)道。本論文研究結(jié)果表明,IBR5對(duì)CHS3的調(diào)控同樣不依賴于MPK12。生化研究表明IBR5與CHS3的N端TIR結(jié)構(gòu)域直接互作,將IBR5保守的磷酸酶功能位點(diǎn)突變不影響IBR5與CHS3的相互作用,卻部分回復(fù)ibr5 chs3的冷敏感表型,證明IBR5的磷酸酶活性是其在CHS3介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮功能所必需的。此外,低溫下CHS3的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的積累均可以被ibr5抑制,說明IBR5是CHS3蛋白積累所必需的,并可能促進(jìn)CHS3的表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)chs3-1的另一個(gè)抑制子是hsp90.3。結(jié)合之前研究發(fā)現(xiàn)的chs3-1的抑制子sgt1b及rarl-20的研究結(jié)果,暗示HSP90-SGT1b-RAR1復(fù)合體正調(diào)控CHS3介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。進(jìn)一步生化結(jié)果表明,IBR5可以與HSP90及SGTlb在植物體內(nèi)形成復(fù)合體,遺傳分析發(fā)現(xiàn)IBR5與HSP90具有協(xié)同作用。這些結(jié)果表明IBR5與HSP90-SGT1b-RAR1形成復(fù)合體,共同保護(hù)CHS3。IBR5除了參與CHS3介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng),還參與其他多種R基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。ibr5可以部分回復(fù)bal/sncl-2及bon1-1在22℃C的免疫反應(yīng),bal及bon1-1的表型都是由于體內(nèi)SNC1(Suppressor of npr1-1, Constitutive 1)蛋白激活造成,IBR5可以與SNC1蛋白的TIR結(jié)構(gòu)域互作,暗示IBR5可以直接調(diào)控SNC1的活性。此外,IBR5的突變還影響了植株對(duì)R蛋白R(shí)PM1 (Resistance to Pseudomonas Maculicola 1)及RPS4 (Resistant to Pseudomonas Syringae 4)介導(dǎo)的病原菌的抗病性,生化證據(jù)顯示IBR5可以與RPS4在植物體內(nèi)形成復(fù)合體。綜上所述,IBR5可能參與了多種R蛋白介導(dǎo)的溫度依賴的防衛(wèi)反應(yīng)調(diào)控。本研究結(jié)果為揭示植物響應(yīng)低溫與病原菌的分子機(jī)制提供了新的線索和證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 溫度 IBR5 CHS3 R蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q946
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略詞表11-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-27
• 1.1 植物的天然免疫反應(yīng)14-21
• 1.1.1 PAMP引發(fā)的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)15-17
• 1.1.2 病原菌效應(yīng)因子抑制植物的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)17-18
• 1.1.3 R基因調(diào)控的次級(jí)免疫反應(yīng)18-21
• 1.2 低溫與植物免疫反應(yīng)的聯(lián)系21-24
• 1.3 分子伴侶在植物免疫反應(yīng)中的作用24-25
• 1.4 本研究的目的和意義25-27
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法27-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 2.1.1 植物材料27
• 2.1.2 菌株27
• 2.1.3 載體27-28
• 2.1.4 主要載體構(gòu)建方法28-29
• 2.1.5 主要酶、抗體和試劑29
• 2.2 常用試劑和培養(yǎng)基配制29-33
• 2.2.1 臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue)染色試劑29
• 2.2.2 DAB染色試劑29-30
• 2.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化液30
• 2.2.4 煙草瞬時(shí)表達(dá)注射緩沖液30
• 2.2.5 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑30-31
• 2.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)相關(guān)試劑31-32
• 2.2.7 植物DNA提取相關(guān)試劑32
• 2.2.8 植物蛋白提取緩沖液32
• 2.2.9 His標(biāo)簽蛋白純化試劑32-33
• 2.2.10 常用培養(yǎng)基配方33
• 2.3 常用實(shí)驗(yàn)儀器33-34
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法34-40
• 2.4.1 植物生長(zhǎng)條件34
• 2.4.2 轉(zhuǎn)基因材料獲得34-35
• 2.4.3 植物DNA提取35
• 2.4.4 植物RNA提取35
• 2.4.5 植物蛋白提取35
• 2.4.6 酵母蛋白提取35
• 2.4.7 Western blot35-36
• 2.4.8 Real-time PCR擴(kuò)增36
• 2.4.9 免疫共沉淀(Co-IP)36
• 2.4.10 酵母雙雜交36
• 2.4.11 螢光素酶互補(bǔ)成像(LCI)實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.4.12 DAB染色37
• 2.4.13 臺(tái)盼藍(lán)染色37
• 2.4.14 接菌實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.4.15 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化38
• 2.4.16 His標(biāo)簽蛋白表達(dá)及純化38
• 2.4.17 Holdase活性檢測(cè)38-40
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析40-75
• 3.1 chs3-1抑制子的篩選與鑒定40-47
• 3.1.1 抑制子的篩選和遺傳分析40-41
• 3.1.2 抑制子suc5的表型分析41-43
• 3.1.3 SUC5基因的圖位克隆43-44
• 3.1.4 suc5的遺傳互補(bǔ)分析44-45
• 3.1.5 ibr5-7是一個(gè)功能缺失突變體45-47
• 3.2 MPK12不參與IBR5對(duì)CHS3的調(diào)控47-49
• 3.2.1 功能缺失突變體mpkl2-3的鑒定47
• 3.2.2 mpk12-3生長(zhǎng)素表型分析47-48
• 3.2.3 mpk12-3不能回復(fù)ibr5 chs3的表型48-49
• 3.3 IBR5與CHS3的TIR結(jié)構(gòu)域直接相互作用49-53
• 3.3.1 IBR5與CHS3的TIR結(jié)構(gòu)域在酵母中相互作用49-50
• 3.3.2 IBR5與CHS3的TIR結(jié)構(gòu)域在植物體內(nèi)相互作用50-52
• 3.3.3 IBR5的磷酸酶活性對(duì)其調(diào)控CHS3是必需的52-53
• 3.4 CHS3蛋白積累依賴IBR553-57
• 3.4.1 ibr5可以回復(fù)chs3-2D-GFP過表達(dá)植株防衛(wèi)反應(yīng)激活的表型53-54
• 3.4.2 chs3-2D蛋白積累依賴IBR554-55
• 3.4.3 IBR5促進(jìn)CHS3的積累55-56
• 3.4.4 IBR5具有holdase活性56-57
• 3.5 IBR5與HSP90、SGT1b共同調(diào)控CHS357-64
• 3.5.1 hsp90.3是chs3的抑制子57
• 3.5.2 HSP90與IBR5具有協(xié)同作用57-59
• 3.5.3 IBR5與HSP90、SGT1b在體內(nèi)形成復(fù)合體59-61
• 3.5.4 CHS3與HSP90、SGT1b在酵母中不能相互作用61-62
• 3.5.5 CHS3與SGTlb在植物體內(nèi)形成復(fù)合體62-64
• 3.6 ibr5部分回復(fù)bal、bon1-1的防衛(wèi)反應(yīng)激活表型64-68
• 3.6.1 ibr5部分回復(fù)bal與bon1-1生長(zhǎng)發(fā)育的表型64-65
• 3.6.2 ibr5部分回復(fù)bal與bon1-1細(xì)胞死亡的表型65
• 3.6.3 ibr5部分回復(fù)bal與bon1-1中的PR基因的表達(dá)65-66
• 3.6.4 ibr5部分回復(fù)bal與bon1-1的抗病表型66
• 3.6.5 IBR5與SNC1相互作用并促進(jìn)其表達(dá)66-68
• 3.7 ibr5部分回復(fù)chs1的防衛(wèi)反應(yīng)激活表型68-70
• 3.7.1 ibr5不能回復(fù)chs1與chs2生長(zhǎng)發(fā)育的表型69
• 3.7.2 ibr5部分回復(fù)chs1的PR基因表達(dá)69
• 3.7.3 IBR5可能負(fù)調(diào)控RPP4-1D的穩(wěn)定性69-70
• 3.8 ibr5參與多種R基因介導(dǎo)的病原菌應(yīng)答70-75
• 3.8.1 ibr5突變影響RPMl和RPS4介導(dǎo)的病原菌應(yīng)答70
• 3.8.2 ibr5突變不影響RPS2介導(dǎo)的病原菌應(yīng)答響應(yīng)和基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)70-71
• 3.8.3 IBR5與RPS4在植物體內(nèi)相互作用71-75
• 第四章 討論與展望75-78
• 4.1 IBR5參與多種R介導(dǎo)的ETI免疫反應(yīng)75-76
• 4.2 IBR5調(diào)控CHS3可能不依賴生長(zhǎng)素及ABA信號(hào)途徑76
• 4.3 IBR5與HSP90-SGT1b復(fù)合體共同調(diào)控CHS376-77
• 4.4 CHS3的作用機(jī)制77-78
• 第五章 結(jié)論78-79
• 參考文獻(xiàn)79-92
• 附錄92-95
• 致謝95-97
• 個(gè)人簡(jiǎn)介97

  本文關(guān)鍵詞：擬南芥雙特異性磷酸酶IBR5在溫度依賴的防衛(wèi)反應(yīng)中的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：279242