本文關(guān)鍵詞：基于基因組、轉(zhuǎn)錄組測序過程中產(chǎn)生的非宿主序列揭示榕小蜂的真菌多樣性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微生物在自然界中扮演重要角色,對一切生物的存在均具有重要意義。在昆蟲中也普遍存在著真菌、細(xì)菌、病毒等,目前對昆蟲-微生物之間的相關(guān)性研究不斷深入,從最初基于分離培養(yǎng)的方法從昆蟲的各個(gè)部位分離到一定的真菌物種(約1%),隨后伴隨生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,我們基于分子指紋圖譜、克隆文庫、下一代測序技術(shù)、單分子測序技術(shù)從昆蟲體內(nèi)檢測到了大量的真菌物種,檢測所得99%真菌物種是采用分離培養(yǎng)技術(shù)而言所不能獲得的。由于高通量技術(shù)可以獲得大量的序列及價(jià)格相對合理,因此眾多科學(xué)家在采用該技術(shù)。伴隨測序技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的昆蟲完成了全基因組和轉(zhuǎn)錄組的測序工作,昆蟲測序產(chǎn)生的所有序列在完成自身的信息分析后,還存在未匹配到宿主組裝基因組的序列,即非宿主序列,這些非宿主序列的數(shù)量比較龐大,可以與宏基因組或宏轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)相媲美,所占的比例約為17%-34%,若在以往的情況下則視為垃圾序列而被丟棄。在本實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用這些非宿主序列研究宿主中存在的真菌信息則具有重要意義。在本實(shí)驗(yàn)中,我們以測序?qū)θ~榕傳粉榕小蜂Ceratosolen solmsi雄蟲基因組產(chǎn)生的所有非宿主序列,測序雌雄蟲的幼蟲、蛹、成蟲的轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的總序列中未匹配到榕小蜂組裝基因組組的非宿主序列,研究榕小蜂中包含的真菌信息。應(yīng)用基因組的非宿主序列研究宿主中存在的真菌信息：本實(shí)驗(yàn)首次基于宿主全基因組序列中非宿主的序列分析了宿主體內(nèi)的真菌,這對于研究已知某種昆蟲體內(nèi)的真菌菌群具有重要意義。本文從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了已公布的全部真菌全基因組(共773個(gè))、兩個(gè)真菌保守基因-ITS基因(ITS參考數(shù)據(jù)庫,共118603條序列)和28S rRNA基因(下載自SLIVA中LSU參考數(shù)據(jù)庫,共1981條序列)、已公布的所有榕樹-榕小蜂體內(nèi)的真菌序列(共313條序列),用Bowtie將非宿主序列與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,比對時(shí)參數(shù)的設(shè)置是：100%相似性、99%相似性、97%相似性、95%相似性。同時(shí)在ITS參考數(shù)據(jù)庫中查找773個(gè)真菌基因組所對應(yīng)的ITS序列,共查找到402個(gè)ITS序列,基于95%的相似性將非宿主序列與402個(gè)ITS序列進(jìn)行比對分析。通過上述比對分析后,可知基因組的非宿主序列中存在大量的真菌信息,ITS可作為最適參考數(shù)據(jù)庫、95%序列相似性作為最適參數(shù)可用于研究非宿主序列中存在的真菌信息。我們的結(jié)果包含兩部分,第一部分是宿主中存在的真菌信息,第二部分是與已知榕小蜂體內(nèi)的真菌信息進(jìn)行比較。第一部分結(jié)果：匹配所得真菌序列所占的比例為0.21%,所對應(yīng)的真菌分類是：10個(gè)門、10個(gè)亞門、32個(gè)綱、159個(gè)屬。其中所得真菌序列數(shù)目最多的是基因組參考數(shù)據(jù)庫,其次是ITS參考數(shù)據(jù)庫；匹配上物種數(shù)最多的是ITS-CS、其次是G-CS；同時(shí)我們的結(jié)果包含所有已公布的榕小蜂真菌的信息。與402個(gè)真菌基因組所對應(yīng)的ITS序列進(jìn)行比對后的結(jié)果可以進(jìn)一步確定非宿主序列可以用于研究宿主中存在的真菌信息。第二部分結(jié)果：與已公布的榕小蜂體內(nèi)的真菌菌群進(jìn)行比較后,對葉榕傳粉榕小蜂雄蟲的真菌多樣性完全包含其他榕小蜂中存在的真菌,并且其多樣性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已公布的結(jié)果。我們的結(jié)果中所特有的真菌即：Agaricomycetes,該真菌綱所包含的屬及物種數(shù)在原始數(shù)據(jù)中為優(yōu)勢屬和優(yōu)勢種。在FD1中Ascomycota和Basidiomycota為優(yōu)勢門,Saccharomycotina、Pezizomycotina、Agaricomycotina、Tremellomycetes為優(yōu)勢亞門,Saccharomycetes、Sordariomycetes、Agaricomycetes, Pezizomycetes和Exobasidiomycetes為優(yōu)勢綱,優(yōu)勢屬有Debaryomyces、Saccharomycopsis、Galactomyces和Tricholoma。通過上述結(jié)果,可知非宿主序列可以用于研究宿主中存在的真菌信息,能系統(tǒng)、全面、方便快捷的揭示宿主中存在的真菌信息,使測序產(chǎn)生的總數(shù)據(jù)產(chǎn)生了更深層次的價(jià)值,為真菌多樣性研究提供新思路和新方法,尤其對于研究個(gè)體較小、體內(nèi)微生物信息不易獲取的宿主更具優(yōu)勢性。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列研究宿主中存在的真菌信息：在本實(shí)驗(yàn)中我們首次用ITS參考數(shù)據(jù)庫分析轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列中存在的真菌信息,首次用轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列揭示宿主不同發(fā)育階段中真菌菌群的動(dòng)態(tài)變化,同時(shí)采用三個(gè)軟件Bowtie1、Bowtie2和Pathoscope2對非宿主序列所揭示的真菌信息進(jìn)行詳細(xì)分析。采用三個(gè)參考數(shù)據(jù)庫：分別為已公布的真菌全基因組、mRNA數(shù)據(jù),從BLAST上下載所有的ITS參考序列。應(yīng)用Bowtie 1在97%相似性時(shí)將非宿主序列與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,用Bowtie 2將Bowtie1比對所得結(jié)果與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,隨后用Pathoscope 2進(jìn)行Bowtie 2結(jié)果的分析。比較分析所得結(jié)果,ITS參考數(shù)據(jù)庫、97%序列相似性能夠充分揭示宿主中存在的真菌信息。首先,選取最適參考數(shù)據(jù)庫。比較分析雄成蟲與真菌基因組、mRNA、ITS比對后所得結(jié)果,可知匹配上的真菌信息最豐富的是ITS參考數(shù)據(jù)庫,而信息最少的是mRNA參考數(shù)據(jù)庫。由此可知,選取ITS參考數(shù)據(jù)庫用于研究非宿主轉(zhuǎn)錄組中存在的真菌信息時(shí)較為合適。隨后比較分析：雄成蟲基因組的非宿主序列(NHRG-CS)中包含的真菌信息與轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列(NHRT-CS)中包含的真菌信息,可知二者既存在共有真菌,也存在各自特有真菌,其中NHRT-CS結(jié)果中2/3的真菌是二者共有的,NHRG-CS結(jié)果中特有的真菌要明顯多于NHRT-CS結(jié)果,這一結(jié)果支持了選取ITS參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析的合理性。其次,選取最優(yōu)參數(shù)。前人對真菌多樣性研究采用的經(jīng)典參數(shù)為97%相似性,在本實(shí)驗(yàn)中我們用97%相似性參數(shù)對所有樣品中匹配所得真菌序列和屬的數(shù)量繪制稀釋曲線,結(jié)果表明蛹期和雌成蟲基本檢測到了所有真菌,幼蟲期和雄成蟲未能充分檢測所存在的真菌信息,這一結(jié)果說明在97%相似性時(shí)基本上可以揭示宿主中存在的真菌信息。再次,真菌菌群的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化。比較各發(fā)育階段中存在的真菌菌群,可知幼蟲期最豐富,其次是成蟲期,最后是蛹期。我們用稀釋曲線的up-95%和lower-95%結(jié)果分析宿主不同發(fā)育階段中的真菌菌群,可知伴隨宿主的生長發(fā)育,其體內(nèi)的真菌菌群呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可知用ITS參考數(shù)據(jù)庫、97%相似性可研究轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列中所包含的真菌信息,尤其對研究具有重要功能的真菌；非宿主序列所揭示的宿主中真菌菌群伴隨宿主的生長發(fā)育而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。通過該研究,將測序宿主基因組和轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的總數(shù)據(jù)體現(xiàn)更深層次的價(jià)值,為真菌多樣性的研究提供新思路和新方法,也為我們深入了解真菌-榕小蜂-榕果之間的互利共生提供儲(chǔ)備。
【關(guān)鍵詞】：非宿主序列 真菌參考數(shù)據(jù)庫 真菌多樣性 榕小蜂
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q93;Q78
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• Abstract13-16
• 1 前言16-35
• 1.1 真菌在昆蟲中的研究概況16-21
• 1.2 研究昆蟲體內(nèi)真菌菌群所采用的方法、技術(shù)21-27
• 1.2.1 真菌DNA提取的方法21
• 1.2.2 真菌物種鑒定所使用的保守基因21-23
• 1.2.3 真菌菌群檢測方法23-27
• 1.2.3.1 純培養(yǎng)法研究真菌菌群23
• 1.2.3.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法研究真菌菌群23-27
• 1.3 榕樹-榕小蜂體系27-30
• 1.4 榕樹-榕小蜂真菌研究概況30-33
• 1.4.1 榕果內(nèi)生真菌研究概況30-32
• 1.4.2 榕小蜂體內(nèi)真菌研究概況32-33
• 1.4.3 傳粉榕小蜂C.solmsi基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)33
• 1.5 立題依據(jù)33-35
• 2 材料與方法35-44
• 2.1 傳粉榕小蜂Ceratosolen solmsi基因組、轉(zhuǎn)錄組中非宿主序列35-36
• 2.1.1 傳粉榕小蜂C. solmsi材料的處理35-36
• 2.1.2 獲取非宿主序列36
• 2.2 參考數(shù)據(jù)庫選取及相關(guān)信息36-38
• 2.3 數(shù)據(jù)分析流程38-44
• 2.3.1 基因組非宿主數(shù)據(jù)與ITS、LSU、真菌全基因組參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析38-40
• 2.3.1.1 最優(yōu)參數(shù)的確定39
• 2.3.1.2 最優(yōu)參考數(shù)據(jù)庫的確定39-40
• 2.3.1.3 非宿主序列與已公布的真菌基因組進(jìn)行比對分析40
• 2.3.1.4 非宿主序列與已公布的榕果-榕小蜂體內(nèi)的真菌序列比對分析40
• 2.3.2 轉(zhuǎn)錄組非宿主序列與真菌ITS、全基因組和mRNA參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析40-44
• 2.3.2.1 最優(yōu)參數(shù)的選取41-42
• 2.3.2.2 最優(yōu)參考數(shù)據(jù)庫的選取42
• 2.3.2.3 構(gòu)建統(tǒng)一的分析標(biāo)準(zhǔn)42
• 2.3.2.4 分析處于不同發(fā)育階段的榕小蜂體內(nèi)真菌多樣性42
• 2.3.2.5 分析榕小蜂體內(nèi)真菌菌群的動(dòng)態(tài)變化情況42-43
• 2.3.2.6 榕小蜂體內(nèi)真菌功能與小蜂的相關(guān)性43-44
• 3 結(jié)果與分析44-67
• 3.1 基因組非宿主序列中真菌信息分析44-54
• 3.1.1 選取最優(yōu)參數(shù)44-47
• 3.1.2 最優(yōu)參考數(shù)據(jù)庫的選取47-48
• 3.1.3 NHRG-CS所揭示的宿主中真菌多樣性48-51
• 3.1.4 NHRG-CS與已知真菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析51-52
• 3.1.5 比較分析NHRG-CS、已公布的榕果-榕小蜂體內(nèi)的真菌菌群52-54
• 3.2 宿主轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列所包含的真菌信息54-67
• 3.2.1 轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列信息54
• 3.2.2 最適參考數(shù)據(jù)庫的選取54-57
• 3.2.3 最優(yōu)參數(shù)的設(shè)置57-60
• 3.2.4 榕小蜂C. solmsi不同發(fā)育階段中的真菌菌群結(jié)構(gòu)60-61
• 3.2.5 榕小蜂C. solmsi體內(nèi)真菌菌群動(dòng)態(tài)變化情況61-64
• 3.2.6 真菌功能與榕小蜂C. solmsi的相關(guān)性64-67
• 4 討論67-76
• 4.1 基因組非宿主序列中真菌菌群研究67-72
• 4.1.1 首次檢測NHRG-CS中存在的真菌信息67-68
• 4.1.2 NHRG-CS中存在的真菌序列數(shù)量68-69
• 4.1.3 NHRG-CS中真菌多樣性69
• 4.1.4 真菌功能與榕小蜂之間的相關(guān)性69-70
• 4.1.5 該方法的準(zhǔn)確性70-72
• 4.2 轉(zhuǎn)錄組非宿主序列中真菌菌群研究72-76
• 4.2.1 應(yīng)用NHRT-CS研究宿主中真菌菌群的可行性72-73
• 4.2.2 ITS參考數(shù)據(jù)庫分析NHRT-CS中真菌多樣性時(shí)方法的優(yōu)勢73-74
• 4.2.3 不同發(fā)育階段中真菌序列的數(shù)量及菌群74
• 4.2.4 不同發(fā)育階段中真菌菌群動(dòng)態(tài)變化情況74-75
• 4.2.5 性別對真菌菌群的影響75-76
• 5 結(jié)論76-78
• 5.1 宿主基因組的非宿主序列研究真菌多樣性76-77
• 5.2 宿主轉(zhuǎn)錄組的非宿主序列研究真菌多樣性77-78
• 6 參考文獻(xiàn)78-87
• 7 附錄87-123
• 附錄一 成蟲-雄性的基因組的非宿主序列能夠匹配到真菌的序列(部分)87-100
• 附錄二 雄蟲轉(zhuǎn)錄組非宿主序列所對應(yīng)的真菌分類情況(部分)100-109
• 附錄三 雌蟲轉(zhuǎn)錄組非宿主序列所對應(yīng)的真菌分類情況(部分)109-118
• 附錄四 轉(zhuǎn)錄組非宿主序列與三個(gè)參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后結(jié)果118-119
• 附錄五 基因組和轉(zhuǎn)錄組非宿主序列：一條序列僅匹配一個(gè)真菌分類信息119-120
• 附錄六 在所有發(fā)育階段中存在的top 11真菌屬的信息120-121
• 附錄七 轉(zhuǎn)錄組非宿主序列的八個(gè)樣品中所包含的真菌屬信息121-123
• 8 致謝123-125
• 9 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況125

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