【摘要】：背景：內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是最近在哺乳動物血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的一群表達CD133、CD31、CD34和VEGFR-2的細胞。越來越多的證據(jù)表明內(nèi)皮祖細胞在血管損傷的修復和病理學的新血管形成過程中起重要作用。內(nèi)皮祖細胞失衡與許多心血管疾病有關,包括人類的肺動脈高壓(PAH)。叢狀病變是PAH病情惡化的特征,指癥為不良預后。最近的研究指出患有嚴重PAH的病人的血液中內(nèi)皮祖細胞增多,帶有叢狀病變的EPCs來源于血液循環(huán)中的EPCs,說明這些細胞與血管再生有關。然而,其中的機制尚不明確。雞的PAH與人類的病情有部分相似之處,包括管壁內(nèi)側(cè)肥厚,內(nèi)膜增殖,及肺血管中閉合的叢狀病變,所以它被認為是研究人類肺動脈高壓的理想模型。同時,我們發(fā)現(xiàn)在叢狀病變中有長期的炎癥反應和HGF的增長性表達,然而其中的機理尚未完全清晰。叢狀病變表現(xiàn)為管腔中出現(xiàn)圓形或裂隙狀的區(qū)域,主要被內(nèi)皮樣細胞填充,也就是EPCs。叢狀病變區(qū)域被T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞等慢性炎癥細胞包圍。另外,炎癥主要集中于動脈病變附近。前期的研究表明由淋巴細胞和巨噬細胞分泌的細胞因子TNF-a,可以降低細胞增殖、細胞遷移、細胞黏附和EPCs的成小管能力。我們假設與淋巴細胞的共培養(yǎng)可以導致EPCs的功能紊亂,這可以解釋叢狀病變中的EPCs維持未分化狀態(tài)不發(fā)育為內(nèi)皮細胞。本研究的主要目的是研究禽類中EPCs的特點,研究HGF在炎癥期間對EPC功能的影響,特別是EPCs對PAH中叢狀病變產(chǎn)生的影響。目前還沒有此類研究對禽類的骨髓進行培養(yǎng),研究其表型特征,比較外周血單核細胞和骨髓單核細胞體外培養(yǎng)的血管再生能力和病理情況下HGF對EPCs的作用。我們主要做了三個方面的實驗：實驗1比較雞骨髓誘導的單核細胞在EGM-2和DMEM培養(yǎng)基中的分化特征,用于比較誘導自這兩種培養(yǎng)基的內(nèi)皮祖細胞有怎樣的生物性狀差異,同時衡量這兩種培養(yǎng)基對體外培養(yǎng)來自雞骨髓的具有血管再生潛能的內(nèi)皮祖細胞的效價。骨髓誘導的單核細胞始終為紡錘樣結(jié)構(gòu),表達CD133、CD31和VEGFR-2。Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1雙陽性細胞實驗顯示組間無顯著差異。培養(yǎng)于EGM-2的BMMNCs能形成管狀結(jié)構(gòu),然而培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基的細胞則不能形成這樣的結(jié)構(gòu)。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)EGM-2更利于EPCs的誘導增殖因為它能使細胞離體培養(yǎng)后增殖,有利于內(nèi)皮分化,遷移,提高細胞體外血管再生能力。而DMEM有利于細胞早期形態(tài)分化,但不支持內(nèi)皮分化,遷移及血管再生能力。通過觀察兩種培養(yǎng)基對雞骨髓誘導的內(nèi)皮祖細胞,我們更進一步觀察到來自快速生長型肉雞骨髓和外周血分離誘導的內(nèi)皮祖細胞表型和體外培養(yǎng)血管再生能力有差異。PBMNCs具有特征性的內(nèi)皮祖細胞形態(tài),最初出現(xiàn)的紡錘樣結(jié)構(gòu),而后呈現(xiàn)為鋪路石狀,而BMMNCs自始至終都為紡錘狀結(jié)構(gòu)。誘導自兩種來源的細胞均表達CD133、CD31和VEGFR-2,而PBMNCs誘導的細胞CD133表達量降低。而Dil-ac-LDL/lectin雙陽性細胞統(tǒng)計結(jié)果顯示兩組沒有差異。誘導自BMMNCs的細胞具有成脂細胞及成骨細胞能力。誘導自PBMNC的細胞在Matrigel中培養(yǎng)能形成管狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),但BMMNC分離的細胞只形成了少量管狀結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果表明自BMMN分離的細胞并不是”真”的EPC,這與前期在哺乳類動物上的發(fā)現(xiàn)骨髓可能不是EPCs最好的分離來源相一致。最后,我們研究了肝細胞生長因子(HGF)對暴露于淋巴細胞的EPCs功能的影響。通過內(nèi)皮細胞特異的ac-LDL吞噬和lectin結(jié)合實驗來確定細胞為EPCs。最后,用HGF/淋巴細胞單獨或聯(lián)合刺激EPCs,將EPCs用0.25%的trypsin-EDTA消化后用于實驗。采用雞外周血中暴露于淋巴細胞的EPCs來檢測內(nèi)源的HGF。5-7天時紡錘樣細胞形成小集落簇在第10天左右分化成為鋪路石樣的單層細胞。與淋巴細胞共培養(yǎng)的EPCs的增殖性較普通培養(yǎng)沒有明顯差異,說明僅與淋巴細胞共培養(yǎng)不會影響內(nèi)皮祖細胞的增殖。有趣的是,當HGF對EPCs的作用濃度為5ng/ml和lOng/ml時,EPCs的增殖被顯著抑制,但當用20ng/ml時,細胞增殖顯著高。在普通培養(yǎng)基中約17.2%的EPCs凋亡,加入了5、10、 20ng/ml的HGF能抑制細胞的死亡。當EPC與淋巴細胞共培養(yǎng)時也可以看到細胞凋亡顯著下降,提示HGF和淋巴細胞能顯著抑制EPC的凋亡。將HGF與淋巴細胞聯(lián)合刺激EPC能更有效的抑制它的凋亡。5ng/ml HGF對暴露于淋巴細胞的EPCs的凋亡有顯著的抑制作用。高濃度(20ng/ml)的HGF顯著提高細胞遷移能力而對細胞增殖有相同的作用。總而言之,暴露于淋巴細胞能顯著提高細胞的遷移能力。同樣的,低濃度HGF(5ng/ml)單獨或聯(lián)合淋巴細胞均顯著提高細胞遷移能力,提示HGF和淋巴細胞在最低濃度是也有協(xié)同作用。量,動員能力,減少細胞死亡,HGF能明顯抑制細胞凋亡,從而提高暴露于淋巴細胞的EPCs的細胞存活能力,所以HGF能提高EPCs的數(shù)量,減少細胞死亡,促進在血管損傷部位和叢狀病變部位管狀結(jié)構(gòu)的形成。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q813;S852.3

【參考文獻】

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1 ;Therapeutic neovascularization by autologous transplantation with expanded endothelial progenitor cells from peripheral blood into ischemic hind limbs[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年09期

本文編號：2773795