本文關(guān)鍵詞：Sprouty1在人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究背景] Sprouty蛋白是1998年Hacohen等在果蠅基因譜的研究中,發(fā)現(xiàn)的Ras/MAPK信號通路特異性抑制蛋白,隨后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)其類似物,分別命名為Spry1-4。在果蠅中,該蛋白家族的分子量為63KD,而在哺乳動物中,分子量為32-34KD。Sprouty1(SPRY1)蛋白是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì),最早對于Spry蛋白的功能研究認(rèn)為,它是FGF介導(dǎo)的RTK信號通路的拮抗劑。SPRY1蛋白受一些生長因子的調(diào)節(jié),如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF),表皮細(xì)胞生長因子(EGF)等的調(diào)節(jié)。同時,SPRY1也對上述一些細(xì)胞因子的作用起到負(fù)性反饋調(diào)節(jié)的作用。在果蠅和其他多種生物中,SprY1蛋白在氣管形成,肺部支氣管形成,腎臟發(fā)生和血管新生中發(fā)揮重要的作用。 人類SPRY蛋白各個組分的表達(dá)在不同的人體組織中有所不同。SPRY1,2和4在胚胎各期及成人組織中廣泛表達(dá),而SPRY3僅表達(dá)于成人的腦和睪丸組織。各個SPRY組分之間并不能發(fā)揮相互補(bǔ)償?shù)淖饔�。人類SPRY1基因位于4q28.1,總共包括5個外顯子,整個基因包括2626bp,編碼蛋白包含319個氨基酸。目前的研究發(fā)現(xiàn),SPRY1基因在人體中存在兩種剪接體,分別被命名為SPRY1a, SPRY1b。SPRY1蛋白具有多個結(jié)構(gòu)功能域,包括C-端富含半胱氨酸的功能域,即Rafl結(jié)合功能域,一個高度保守的N-端功能域。因SPRY蛋白家族(SPRY1-4)中的各組分之間的結(jié)構(gòu)相似性,因此被認(rèn)為該組蛋白具有類似的RTK通路的抑制作用。 SPRY1蛋白作為多種生長因子信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。SPRY1的表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞表型類似于細(xì)胞因子過度激活的狀態(tài)。SPRY1在多種細(xì)胞類型的腫瘤中表達(dá)下調(diào),包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌,尤其在晚期腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。表觀調(diào)節(jié)使SPRY1失活或雜合性缺失被認(rèn)為是SPRY1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下降或功能缺失的主要原因。因SPRY1可以拮抗RTK信號通路,從而發(fā)揮抗增殖、遷移,調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和衰老的重要作用。因此,SPRY1被認(rèn)為具有腫瘤抑制作用。 目前,對于影響SPRY1的表達(dá)的調(diào)節(jié)因素還不是很清楚。如多種生長因子、血清剝奪等影響。一些研究指出,在不同的細(xì)胞背景下,上述影響因素對SPRY1的調(diào)節(jié)并不盡相同。目前尚未發(fā)現(xiàn)SPRY1基因突變所直接導(dǎo)致的疾病。但是有研究顯示,SPRY1基因還與肥胖、骨代謝異常等復(fù)雜性疾病狀態(tài)密切相關(guān)。 皮膚是人體的第一道防線,按結(jié)構(gòu)可分為表皮、真皮和皮下組織。角質(zhì)形成細(xì)胞作為表皮的最主要的結(jié)構(gòu)性細(xì)胞,是一種不斷增殖、分化和更新的細(xì)胞,其增殖和分化過程受到多種因素的精細(xì)調(diào)節(jié)�；讓邮潜砥さ纳l(fā)層。角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化狀態(tài)被認(rèn)為至少具有三種狀態(tài),即表皮干細(xì)胞、短暫增殖細(xì)胞和分化細(xì)胞。近年來的研究發(fā)現(xiàn),多種生長因子和細(xì)胞因子可影響角質(zhì)形成細(xì)胞動力學(xué)過程,如表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、IL-6、TNF-α維A酸、micro-RNA等對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生影響。 SPRY1被認(rèn)為是具有RTK信號通路負(fù)性調(diào)節(jié)作用的重要分子。在正常人體表皮中,SPRY1對人體角質(zhì)形成細(xì)胞的功能的影響以及生物學(xué)行為,如角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、增殖、細(xì)胞周期、衰老、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚不清楚,因此,值得深入探討和研究；并為今后研究該蛋白分子在一些表皮增殖相關(guān)性皮膚疾病中的作用及其機(jī)制提供重要線索。 [目的] 本研究主要觀察SPRY1在正常人體表皮中的表達(dá),以及原代培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)和定位；通過慢病毒感染構(gòu)建過表達(dá)SPRY1的角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞,研究SPRY1對ERK、smad等細(xì)胞信號通路,對細(xì)胞周期、增殖、分化等相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),以及組蛋白乙酰化和甲基化修飾等的影響,以期了解SPRY1的一些重要的下游靶蛋白；觀察SPRY1對細(xì)胞功能的影響；觀察K14表皮定位表達(dá)SPRY1小鼠在銀屑病模型、皮膚接觸性變態(tài)反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、急性刺激性炎癥反應(yīng)等方面的影響。 [方法] 首先,通過對正常人體皮膚的組織免疫熒光檢測,觀察原位正常人表皮中SPRY1的表達(dá)定位和豐度。分離和培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞,并通過細(xì)胞免疫熒光觀察其中的SPRY1的表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位； 其次,為進(jìn)一步研究SPRY1在角質(zhì)形成細(xì)胞中的功能,我們通過構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)DH5α菌擴(kuò)增,通過工具細(xì)胞-HEK293T細(xì)胞包裝病毒,再用慢病毒感染原代角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞,建立過表達(dá)SPRY1的細(xì)胞模型,并通過RT-PCR和western blot確認(rèn)慢病毒的感染效果。利用Western blot分析SPRY1過表達(dá)后其下游蛋白分子,如MAPK、PI3K-AKT、TGF-p/smad信號通路以及與表皮屏障功能、細(xì)胞分化和細(xì)胞周期等密切相關(guān)的蛋白表達(dá)水平； 此外,還檢測了SPRY1對細(xì)胞組蛋白甲基化和乙�；缺碛^修飾水平的影響。再次,通過SPRY1過表達(dá)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的建立和篩選,進(jìn)一步研究過表達(dá)SPRY1的HaCaT細(xì)胞在細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等方面的影響； 最后,為進(jìn)一步研究SPRY1在表皮中的作用,本研究通過表皮定位表達(dá)K14-SPRY1-eGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠的建立,在體(in vivo)研究過表達(dá)SPRY1對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型、環(huán)鉆創(chuàng)傷修復(fù)模型、惡唑酮誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型,以及佛波脂和斑蝥素誘導(dǎo)的急性刺激性皮膚炎癥反應(yīng)模型中的影響。 [結(jié)果] 一、SPRY1在表皮和原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá) 1.通過組織免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),在正常人表皮中SPRY1的表達(dá)僅局限于表皮的顆粒層,呈波浪狀線狀熒光分布,在表皮其它各層中未見明顯表達(dá)。 2.在體外原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1的表達(dá)水平較低,呈胞漿分布。 二、SPRY1對角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白表達(dá)和功能的影響 1.在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1對p53和磷酸化的p53水平并未發(fā)生明顯改變,但可促進(jìn)P21,P27的表達(dá),下調(diào)cyclin B1, G0S2的表達(dá),這可能與SPRY1對細(xì)胞周期的抑制作用有關(guān)； 2. SPRY1對細(xì)胞晚期分化和表皮屏障相關(guān)組分的影響 角質(zhì)形成細(xì)胞過表達(dá)SPRY1后,K1,K10,filaggrin和involucrin的表達(dá)并未發(fā)生明顯改變。但AQP7、Iaminin5的表達(dá)增加,loricrin的表達(dá)可見上調(diào),上述結(jié)果顯示,過表達(dá)：SPRY1可能與角質(zhì)形成細(xì)胞的晚期分化和皮膚屏障功能有關(guān)； 3. SPRY1對角質(zhì)形成細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響 SPRY1對角質(zhì)形成細(xì)胞vimentin. E-cadherin, N-cadherin和β-catenin的表達(dá)沒有明顯改變。PAI-1表達(dá)上調(diào),integrin α6、MMP3表達(dá)減少。而PAI-1的上調(diào)和MMP3的下調(diào)可限制角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力； 4. SPRY1對角質(zhì)形成細(xì)胞polycomb group protein (PcG)蛋白的影響 在SPRY1過表達(dá)的角質(zhì)形成細(xì)胞中,Ring1B、EZH2和Bmil可見不同程度的下調(diào),而SUZ12表達(dá)上調(diào)。生長反應(yīng)蛋白-1(Egr-1)呈現(xiàn)輕度下調(diào)。Dickkopf1(DKK1)并未發(fā)現(xiàn)明顯的表達(dá)改變； 5. SPRY1對細(xì)胞中組蛋白修飾(甲基化和乙�；�)相關(guān)蛋白的影響 在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1可使H3K4me2(lysine4, lysine27, lysine9)表達(dá)上調(diào)。然而,H3K79me2(lysine79, lysine36)和H3me3(H3tri-methylation)的表達(dá)并未發(fā)現(xiàn)明顯改變。H2A, H2B, H3和H4,乙酰化的H2A, H2B, H3和H4也并未發(fā)現(xiàn)顯著改變。HDAC1,2,3,4和6無顯著改變,但是,磷酸化的HDAC4/5/7可見顯著性降低； 6.SPRY1對HMG蛋白表達(dá)的影響 在SPRY1過表達(dá)的角質(zhì)形成細(xì)胞模型中,HMG蛋白家族,包括HMGA1、 HMGB1、HMGB2、HMGN1和HMGN2并未發(fā)現(xiàn)顯著改變； 7. SPRY1對smad、ERK1/2、PTEN和AKT等信號通路的影響 SPRY1對角質(zhì)形成細(xì)胞的經(jīng)典的信號通路的影響并不像其他腫瘤細(xì)胞系一樣,SPRY1對角質(zhì)形成細(xì)胞的smad、ERK1/2、PTEN和AKT的磷酸化及其整體表達(dá)水平影響并不明顯； 8. SPRY1對HaCaT細(xì)胞增殖、遷移、衰老和凋亡的影響 SPRY1過表達(dá)HaCaT細(xì)胞的增殖活力較對照組降低約30%。遷移、侵襲能力較對照組HaCaT細(xì)胞約降低29.9%。在穩(wěn)轉(zhuǎn)SPRY1的HaCaT細(xì)胞中,其凋亡的細(xì)胞比率(9.03%)較對照組-空白質(zhì)粒慢病毒感染細(xì)胞(3.8%)更高,且差異具有顯著性(**P0.01)。而在過表達(dá)SPRY1的角質(zhì)形成細(xì)胞中的細(xì)胞衰老率較對照組HaCaT細(xì)胞更低(8.2%/19.5%)。 S. SPRY1對小鼠炎癥和創(chuàng)傷等皮膚模型的影響 1.SPRY1轉(zhuǎn)基因小鼠,在咪喹莫特乳膏外用誘導(dǎo)的銀屑病模型中,呈現(xiàn)較輕的紅斑鱗屑等銀屑病樣皮膚反應(yīng)。在皮損組織的HE染色中,可見SPRY1轉(zhuǎn)基因小鼠的表皮增殖程度較野生型小鼠更輕； 2.在環(huán)鉆取皮建立的創(chuàng)傷修復(fù)模型中,SPRY1轉(zhuǎn)基因小鼠的創(chuàng)面修復(fù)時間較野生型小鼠延長,即呈現(xiàn)更緩慢的創(chuàng)傷修復(fù)過程； 3.在經(jīng)3%惡唑酮誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮膚炎癥反應(yīng)模型中,SPRY1轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)較輕的耳廓腫脹和炎癥反應(yīng),經(jīng)HE和masson三色染色法比較可見小鼠耳廓厚度的顯著性差異； 4.在經(jīng)佛波脂和斑蝥素誘導(dǎo)的急性刺激性炎癥反應(yīng)中,轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠均可見類似的耳廓腫脹和增厚,但兩組之間并未呈現(xiàn)出顯著的差別。 [結(jié)論] 一、在正常人表皮中,SPRY1局限性表達(dá)于表皮顆粒層； 二、在正常人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)水平較低,呈胞漿分布； 三、在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1促進(jìn)P21,P27的表達(dá)上調(diào),cyclin B1和GOS2下調(diào)；組蛋白的甲基化水平改變,如H3K4me2(lysine4, lysine27, lysine9)表達(dá)上調(diào),以及磷酸化的HDAC4/5/7的顯著降低等,可能與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活力下降和凋亡增加有關(guān)； 四、在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1可促進(jìn)AQP7、Iaminin5、loricrin的表達(dá),因此SPRY1與角質(zhì)形成細(xì)胞的晚期分化和維持皮膚屏障功能有關(guān)； 五、SPRY1促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞PAI-1的表達(dá),降低integrin α6、MMP3的表達(dá),這可能與角質(zhì)形成細(xì)胞的EMT活力和遷移能力下降有關(guān)； 六、在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1對HMG蛋白家族并未產(chǎn)生明顯改變,對PcG蛋白家族組分的表達(dá)產(chǎn)生不同程度的影響(Ring1B、EZH2和Bmil下調(diào),SUZ12表達(dá)上調(diào)),其具體機(jī)制和效應(yīng)有待深入研究； 七、在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1并未對smad、ERK、PTEN和AKT的磷酸化及其整體水平產(chǎn)生明顯改變,這可能是在角質(zhì)形成細(xì)胞中,SPRY1并不主要依賴于上述信號通路而發(fā)揮作用； 八.SPRY1可降低HaCaT細(xì)胞增殖和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡；SPRY1對細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用； 九、在表皮局限性定位表達(dá)SPRY1的轉(zhuǎn)基因小鼠中,SPRY1可減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損程度,延遲創(chuàng)傷修復(fù),減輕惡唑酮誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮膚炎癥的程度,但對佛波脂和斑蝥素誘導(dǎo)的急性刺激性炎癥反應(yīng)無明顯改變。
【關(guān)鍵詞】：sprouty1 角質(zhì)形成細(xì)胞(角質(zhì)細(xì)胞) 表皮 轉(zhuǎn)基因小鼠 咪喹莫特
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R338.3
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-13
• ABSTRACT13-18
• 本課題中使用到的主要儀器18-20
• 實(shí)驗(yàn)中主要試劑的配制20-24
• 英文縮寫注釋24-26
• 目錄26-28
• 第一部分 SPROUTY1蛋白在正常表皮及角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)28-49
• 前言28-38
• 材料與方法38-41
• 結(jié)果41-43
• 討論43-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 第二部分 SPROUTY1在正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和HACAT細(xì)胞中的功能研究49-85
• 前言49-50
• 材料與方法50-62
• 結(jié)果62-77
• 討論77-81
• 結(jié)論81-82
• 參考文獻(xiàn)82-85
• 第三部分 SPROUTY1轉(zhuǎn)基因小鼠在體功能研究85-108
• 前言85-86
• 材料與方法86-91
• 結(jié)果91-103
• 討論103-105
• 結(jié)論105-106
• 參考文獻(xiàn)106-108
• 綜述一108-116
• 參考文獻(xiàn)113-116
• 綜述二116-124
• 參考文獻(xiàn)121-124
• 博士在讀期間發(fā)表的論文124-126
• 博士在讀期間參加的課題、學(xué)術(shù)活動與受到的獎勵

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 秦超;董慧;楊健;李普;朱建;居小兵;孟小鑫;殷長軍;;Sprouty2蛋白表達(dá)對腎癌細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];現(xiàn)代泌尿外科雜志;2012年03期

  本文關(guān)鍵詞：Sprouty1在人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：272287