本文關(guān)鍵詞：Hippo通路效應(yīng)蛋白YAP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Hippo信號(hào)通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條在進(jìn)化上具有保守功能的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它在調(diào)控器官大小、組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),該通路接受多種上游信號(hào),如G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào),機(jī)械壓力,細(xì)胞骨架信號(hào)等,通過其核心激酶鏈作用于下游效應(yīng)蛋白YAP/TAZ,進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮各種生物學(xué)功能。因此,YAP/TAZ如何通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)Hippo信號(hào)通路功能是Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及器官發(fā)育和癌癥研究的重要課題。YAP/TAZ作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子,不能直接結(jié)合DNA,需要借助于靶轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)了YAP的關(guān)鍵靶轉(zhuǎn)錄因子TEAD家族在Hippo通路對(duì)基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而,我們也發(fā)現(xiàn)一部分YAP靶基因的表達(dá)依賴于YAP上的一種介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的WW結(jié)構(gòu)域。這提示一些與WW結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子可能參與了Hippo信號(hào)通路的功能。生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了一些含有PPXY基序的轉(zhuǎn)錄因子,如Smads, TBX5, Runx2, p73, ErbB4等能夠與YAP/TAZ的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合。然而,這些轉(zhuǎn)錄因子是否介導(dǎo)YAP/TAZ的依賴于WW結(jié)構(gòu)域的靶基因表達(dá)還不清楚,它們?cè)贖ippo通路調(diào)控器官大小和癌癥中的功能也不明確。本項(xiàng)研究從一個(gè)同時(shí)依賴于TEAD和YAP的WW結(jié)構(gòu)域的YAP靶基因整合素ITGB2的表達(dá)調(diào)控入手,通過轉(zhuǎn)錄因子文庫篩選和親和純化兩種系統(tǒng)性手段發(fā)現(xiàn)了YAP結(jié)合的新轉(zhuǎn)錄因子組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶家族成員PRDM4。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)1TEAD和PRDM4分別結(jié)合在ITGB2啟動(dòng)子的不同位點(diǎn),并通過與YAP相互作用協(xié)同激活I(lǐng)TGB2的表達(dá)。功能研究發(fā)現(xiàn)ITGB2的誘導(dǎo)表達(dá)可能在YAP/TAZ調(diào)控細(xì)胞粘著和遷移中發(fā)揮作用。而PRDM4還可能通過其它靶基因在YAP誘導(dǎo)的細(xì)胞癌癥轉(zhuǎn)化與腫瘤形成中發(fā)揮功能。此外,本項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)了Hippo通路存在一個(gè)依賴于轉(zhuǎn)錄活性的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。我們意外地發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)激活型的YAP突變體強(qiáng)烈誘導(dǎo)內(nèi)源YAP的磷酸化和失活。這提示YAP可以啟動(dòng)一個(gè)負(fù)反饋機(jī)制從而限制自身活性。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)YAP通過TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子直接激活上游抑制性激酶Lats2的表達(dá)和活性。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),這一反饋機(jī)制不僅在細(xì)胞響應(yīng)Hippo信號(hào)通路上游信號(hào)如血清和細(xì)胞失去接觸抑制時(shí)被激活,也在小鼠肝臟內(nèi)YAP誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的過程中被激活。因此該機(jī)制可能在機(jī)體應(yīng)對(duì)體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境,保持器官大小穩(wěn)態(tài),抑制腫瘤發(fā)生上發(fā)揮重要作用。總之,通過研究Hippo信號(hào)通路效應(yīng)分子YAP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制和功能我們發(fā)現(xiàn)了Hippo信號(hào)通路新的靶轉(zhuǎn)錄因子和靶基因,發(fā)現(xiàn)了Hippo通路調(diào)控細(xì)胞粘著、遷移、轉(zhuǎn)化、腫瘤形成以及自身穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄水平分子機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：Hippo通路 轉(zhuǎn)錄 反饋 YAP PRDM4 ITGB2 Lats2
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 致謝5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞清單11-17
• 第1章 引言17-56
• 1.1 Hippo通路的組成17-25
• 1.1.1 果蠅中Hippo通路的組成17-21
• 1.1.2 哺乳動(dòng)物Hippo通路的組成21-25
• 1.2 Hippo通路的生物學(xué)功能25-36
• 1.2.1 Hippo通路調(diào)控器官大小25
• 1.2.2 Hippo通路調(diào)控調(diào)控干細(xì)胞自我更新與組織再生25-31
• 1.2.3 Hippo通路調(diào)控癌癥發(fā)生31-36
• 1.3 YAP是一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔激活因子36-39
• 1.3.1 YAP結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TEAD36-37
• 1.3.2 YAP的WW結(jié)構(gòu)域參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控37-38
• 1.3.3 YAP調(diào)控的靶基因38-39
• 1.4 YAP的調(diào)控機(jī)制39-43
• 1.4.1 磷酸化修飾對(duì)YAP的調(diào)控39-40
• 1.4.2 蛋白質(zhì)相互作用對(duì)YAP的調(diào)控40-41
• 1.4.3 VGLL4對(duì)YAP的抑制41-43
• 1.5 PRDM4與甲基化轉(zhuǎn)移酶家族43-46
• 1.5.1 SET結(jié)構(gòu)域與組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶43-45
• 1.5.2 PRDM家族蛋白分類與甲基化酶活性45
• 1.5.3 PRDM4的分子基礎(chǔ)與生物學(xué)功能45-46
• 1.6 β2整合素46-54
• 1.6.1 整合素的結(jié)構(gòu)47-48
• 1.6.2 整合素的調(diào)節(jié)48-50
• 1.6.3 整合素參與的inside-out信號(hào)通路與outside-in信號(hào)通路50
• 1.6.4 β2整合素的分類、表達(dá)、配體與功能50-54
• 1.7 本研究的目的和意義54-56
• 第2章 材料與方法56-78
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料56-67
• 2.1.1 細(xì)胞56
• 2.1.2 小鼠56
• 2.1.3 質(zhì)粒56-57
• 2.1.4 抗體57-58
• 2.1.5 siRNA,shRNA與gRNA靶序列58-59
• 2.1.6 CHIP引物序列59
• 2.1.7 主要儀器59-60
• 2.1.8 主要試劑60-62
• 2.1.9 主要溶液的配制62-67
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法67-78
• 2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建67
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)67-68
• 2.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染,感染與穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建68-69
• 2.2.4 RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR69-70
• 2.2.5 免疫印跡70-72
• 2.2.6 免疫共沉淀72-73
• 2.2.7 體外激酶活性實(shí)驗(yàn)73
• 2.2.8 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)73-74
• 2.2.9 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)74-75
• 2.2.10 flow chamber細(xì)胞粘著實(shí)驗(yàn)75-76
• 2.2.11 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)76
• 2.2.12 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)76-77
• 2.2.13 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)77
• 2.2.14 流體動(dòng)力注射小鼠模型(HDI)77
• 2.2.15 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)77-78
• 第3章 YAP通過PRDM4調(diào)控整合素ITGB2表達(dá)的機(jī)制與功能研究78-105
• 3.1 ITGB2是YAP的靶基因78-83
• 3.2 YAP通過結(jié)合TEAD和另一個(gè)含PPXY基序的轉(zhuǎn)錄因子激活I(lǐng)TGB283-86
• 3.3 PRDM4是YAP結(jié)合的含PPXY基序的轉(zhuǎn)錄因子86-90
• 3.4 PRDM4誘導(dǎo)ITGB2的表達(dá)90-92
• 3.5 TEAD與PRDM4在ITGB2啟動(dòng)子上的結(jié)合的位點(diǎn)分析92-95
• 3.6 PRDM4與ITGB2在YAP誘導(dǎo)的細(xì)胞粘著與遷移中的作用95-98
• 3.7 PRDM4與ITGB2在YAP誘導(dǎo)的腫瘤形成中的作用98-100
• 3.8 PRDM4結(jié)合YAP調(diào)控的其它靶基因與功能100-102
• 3.9 本章小結(jié)與討論102-105
• 第4章 YAP通過誘導(dǎo)Lats2表達(dá)形成Hippo通路活性負(fù)反饋機(jī)制105-113
• 4.1 激活型YAP誘導(dǎo)Lats2的表達(dá)和活性105-106
• 4.2 激活型YAP對(duì)Lats2的調(diào)控依賴于TEAD106-107
• 4.3 YAP-TEAD直接結(jié)合到Lats2的啟動(dòng)子107-108
• 4.4 Hippo通路生理刺激激活YAP誘導(dǎo)的負(fù)反饋機(jī)制108-109
• 4.5 YAP激活誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程激活負(fù)反饋機(jī)制109-111
• 4.6 本章小結(jié)與討論111-113
• 參考文獻(xiàn)113-133
• 作者簡(jiǎn)歷及科研成果133

  本文關(guān)鍵詞：Hippo通路效應(yīng)蛋白YAP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：270694