本文關(guān)鍵詞：嗜熱內(nèi)切纖維素酶AcCel12B的酶學(xué)性質(zhì)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木質(zhì)纖維素是世界上來源豐富的可再生資源。綜合運用物理、化學(xué)和生物的方法,將木質(zhì)纖維素降解為單糖及寡糖,進(jìn)而用微生物發(fā)酵生產(chǎn)大宗化學(xué)品,是解決人類嚴(yán)重依賴化石資源的有效途徑之一。目前廣泛使用的商品纖維素酶主要來源于中溫真菌,而高溫微生物產(chǎn)生的纖維素酶與之相比,具有顯著的優(yōu)勢,因此,高溫纖維素酶系的研究受到廣泛的關(guān)注。根據(jù)催化反應(yīng)過程中對底物的作用方式不同,一般將纖維素酶分為內(nèi)切纖維素酶,外切纖維素酶或纖維二糖水解酶,和β-葡萄糖苷酶三種類型。纖維素酶降解纖維素是一個協(xié)同的酶促反應(yīng)過程,內(nèi)切纖維素酶首先進(jìn)攻纖維素的無定型區(qū)域,為纖維二糖水解酶漸進(jìn)性水解纖維素提供更多的作用位點,纖維二糖水解酶從纖維素的還原端或非還原端切下纖維二糖,最后β-葡萄糖苷酶將纖維寡糖和纖維二糖水解為葡萄糖,從而可以防止產(chǎn)生的纖維二糖對纖維二糖水解酶產(chǎn)生阻遏作用。此外,有些微生物分泌的纖維素酶及相關(guān)的酶亞基能夠在體外自組裝到腳手架蛋白上,形成復(fù)雜的纖維小體。另外,糖磷酸化酶、裂解酶、氧化酶等也在木質(zhì)纖維素的降解中扮演了重要角色。嗜熱細(xì)菌Acidothermus cellulolyticus 11B可在高溫酸性條件下,利用木質(zhì)纖維素快速生長。基因組分析表明,該菌種產(chǎn)生豐富的纖維素酶,對該菌中纖維素酶的表征及功能分析具有重要的意義和潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。來源于A.cellulolyticus 11B中的內(nèi)切纖維素酶(Ac Cel12B,E.C.3.2.1.4)和纖維二糖水解酶(Ac Cbh48,E.C.3.2.1.91)是典型的模塊酶,而β-葡萄糖苷酶(Ac Bgl1,E.C.3.2.1.21)僅有一個催化結(jié)構(gòu)域。Ac Cel12B的功能模塊依次為催化模塊(屬于糖苷水解酶第12家族,GH12)和纖維素結(jié)合模塊(屬于纖維素結(jié)合模塊第二家族,CBM_2),這兩個模塊由一個富含脯氨酸/絲氨酸Linker結(jié)構(gòu)域相連接。Ac Cbh48的功能模塊依次為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(屬于纖維素結(jié)合模塊第三家族,CBM_3a)、催化模塊(屬于糖苷水解酶第48家族,GH48)、纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域(FN3)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(屬于纖維素結(jié)合模塊第二家族,CBM_2),由三個富含脯氨酸/絲氨酸Linker結(jié)構(gòu)域相連接。模塊酶的功能模塊之間的協(xié)同作用是通過Linker介導(dǎo)的,但是其介導(dǎo)的機(jī)制還不清楚。為此,本論文克隆、異源表達(dá)了來源于嗜熱細(xì)菌A.cellulolyticus 11B的內(nèi)切纖維素酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶;對內(nèi)切纖維素酶的底物特異性、產(chǎn)物特異性及其協(xié)同水解纖維素酶等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究;構(gòu)建了內(nèi)切纖維素酶的截短突變體并對其性質(zhì)進(jìn)行研究。本論文主要獲得如下結(jié)果:(1)克隆了嗜熱菌株A.cellulolyticus 11B的Ac Cel12B、Ac Cbh48和Ac Bgl1基因,以p ET-20b為表達(dá)載體,以E.coli BL 21為宿主菌對這三個基因進(jìn)行了異源表達(dá),但是Ac Cbh48未能成功表達(dá)純化;(2)對Ac Cel12B和Ac Bgl1的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征,結(jié)果表明Ac Cel12B以再生無定型纖維素(RAC)為底物時,其最適溫度為72oC,最適p H為4.3,在70oC下孵育2h仍殘余50%以上的酶活性,此酶在高溫下水解纖維素底物表現(xiàn)出了很高的酶活力。Ac Bgl1以p NPGlc為底物時,最適溫度為70oC,最適p H為7.0,可漸進(jìn)性水解纖維寡糖生成葡萄糖。(3)Ac Cel12B與Ac Bgl1的分子間協(xié)同作用的初步研究,結(jié)果表明:Ac Cel12B水解RAC的主要產(chǎn)物為纖維二糖和纖維三糖,Ac Bgl1以纖維二糖和纖維三糖為底物生成葡萄糖,二者在水解不溶性底物RAC時表現(xiàn)出良好的正協(xié)同性,反應(yīng)2 h時Ac Cel12B和Ac Bgl1的最佳摩爾比為1:4;(4)設(shè)計了Linker截短突變體(Ac Cel12B△PS)對Linker的功能進(jìn)行研究,經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)分析表明,Ac Cel12B△PS與Ac Cel12B一樣表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性和較高的酶活力。而內(nèi)切纖維素酶Linker區(qū)域的變化,尤其是PS剛性結(jié)構(gòu)的去除會使Linker區(qū)域柔性的發(fā)生改變,導(dǎo)致酶對水解不溶性底物的比活和水解率均有所降低,酶的熱穩(wěn)定性也受到影響,但增強(qiáng)了蛋白在中性條件下的p H穩(wěn)定性。綜上所述,本課題對源于A.cellulolyticus 11B中的嗜熱纖維素酶學(xué)性質(zhì)、協(xié)同作用及Linker突變體的功能研究,有助于進(jìn)一步深入理解纖維素酶結(jié)構(gòu)域的功能和催化機(jī)理,為進(jìn)一步的理論研究提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：嗜熱微生物 纖維素酶 截短突變體 Acidothermus cellulolyticus 11B 水解時間進(jìn)程 協(xié)同作用
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 第1章 前言15-33
• 1.1 纖維素與生物質(zhì)能源15-16
• 1.1.1 纖維素結(jié)構(gòu)15-16
• 1.1.2 纖維素生物燃料轉(zhuǎn)化16
• 1.2 纖維素酶16-21
• 1.2.1 纖維素酶分類和分子結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2.2 纖維素酶催化機(jī)理18-20
• 1.2.3 纖維素酶應(yīng)用20-21
• 1.3 嗜熱微生物源纖維素酶21-24
• 1.4 立題依據(jù)和實驗設(shè)計24-26
• 1.5 參考文獻(xiàn)26-33
• 第2章 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B的性質(zhì)研究33-71
• 2.1 引言33-34
• 2.2 實驗材料34-39
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒34-35
• 2.2.2 培養(yǎng)基35-36
• 2.2.3 試劑36-37
• 2.2.4 溶液配制37-38
• 2.2.5 主要儀器38-39
• 2.3 實驗方法39-47
• 2.3.1 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B的序列分析39
• 2.3.2 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B基因的克隆、構(gòu)建與表達(dá)39-42
• 2.3.3 重組內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B的純化42-43
• 2.3.4 蛋白濃度的測定43
• 2.3.5 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B酶活力的測定43
• 2.3.6 最適p H、最適溫度以及熱穩(wěn)定性測定43-44
• 2.3.7 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響44
• 2.3.8 酶底物特異性測定44-45
• 2.3.9 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B動力學(xué)常數(shù)測定45
• 2.3.10 HPLC法測定產(chǎn)物譜45
• 2.3.11 酶對寡糖水解能力的測定45-46
• 2.3.12 不溶性底物水解進(jìn)程的測定46
• 2.3.13 Ac Cel12B對Avicel吸附性測定46
• 2.3.14 熱力學(xué)穩(wěn)定性分析46
• 2.3.15 分子建模與底物對接46-47
• 2.4 結(jié)果與分析47-63
• 2.4.1 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B的序列分析47-49
• 2.4.2 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B基因的克隆與構(gòu)建49-50
• 2.4.3 內(nèi)切纖維素酶Ac Cel12B的表達(dá)和純化50-51
• 2.4.4 最適p H、最適溫度以及熱穩(wěn)定性測定51-54
• 2.4.5 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響54
• 2.4.6 酶底物特異性測定54-55
• 2.4.7 酶動力學(xué)常數(shù)測定55-56
• 2.4.8 HPLC法測定產(chǎn)物譜56-57
• 2.4.9 酶對寡糖水解能力的測定57-58
• 2.4.10 不溶性底物水解進(jìn)程的測定58-60
• 2.4.11 Ac Cel12B對Avicel吸附性測定60
• 2.4.12 熱力學(xué)穩(wěn)定性分析60-61
• 2.4.13 分子建模與底物對接61-63
• 2.5 小結(jié)63-65
• 2.6 參考文獻(xiàn)65-71
• 第3章 Ac Cel12B纖維素酶協(xié)同作用的研究71-91
• 3.1 引言71-72
• 3.2 實驗材料72-73
• 3.2.1 菌株與質(zhì)粒72
• 3.2.2 培養(yǎng)基72-73
• 3.2.3 試劑73
• 3.2.4 溶液配制73
• 3.2.5 主要儀器73
• 3.3 實驗方法73-75
• 3.3.1 纖維素酶基因的克隆、構(gòu)建與表達(dá)73-74
• 3.3.2 重組纖維素酶的純化74
• 3.3.3 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1的性質(zhì)表征74
• 3.3.4 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1底物特異性測定74-75
• 3.3.5 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1對寡糖水解能力的測定75
• 3.3.6 纖維素酶協(xié)同性測定75
• 3.4 結(jié)果與分析75-87
• 3.4.1 纖維素酶的序列分析75-81
• 3.4.2 纖維素酶基因的克隆、構(gòu)建與表達(dá)81-82
• 3.4.3 纖維素酶的表達(dá)和純化82-83
• 3.4.4 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1的性質(zhì)表征83-84
• 3.4.5 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1底物特異性測定84
• 3.4.6 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1對寡糖水解能力的測定84-86
• 3.4.7 纖維素酶協(xié)同性測定86-87
• 3.5 小結(jié)87-88
• 3.6 參考文獻(xiàn)88-91
• 第4章 Ac Cel12B中Linker作用的研究91-111
• 4.1 引言91-92
• 4.2 實驗材料92-93
• 4.2.1 菌株與質(zhì)粒92
• 4.2.2 培養(yǎng)基92-93
• 4.2.3 試劑93
• 4.2.4 溶液配制93
• 4.2.5 主要儀器93
• 4.3 實驗方法93-97
• 4.3.1 序列分析93
• 4.3.2 突變體基因的克隆、構(gòu)建與表達(dá)93-95
• 4.3.3 突變體重組蛋白的純化95
• 4.3.4 蛋白濃度的測定95
• 4.3.5 突變體酶活力的測定95
• 4.3.6 最適p H、最適溫度以及熱穩(wěn)定性測定95-96
• 4.3.7 突變體酶動力學(xué)常數(shù)測定96
• 4.3.8 HPLC法測定產(chǎn)物譜96
• 4.3.9 不溶性底物水解進(jìn)程的測定96
• 4.3.10 熱力學(xué)穩(wěn)定性分析96-97
• 4.4 結(jié)果與分析97-106
• 4.4.1 序列分析97-99
• 4.4.2 突變體基因的克隆、構(gòu)建與表達(dá)99-100
• 4.4.3 突變體蛋白的表達(dá)和純化100-101
• 4.4.4 最適p H、最適溫度以及熱穩(wěn)定性測定101-104
• 4.4.5 酶動力學(xué)常數(shù)測定104
• 4.4.6 HPLC法測定產(chǎn)物譜104-105
• 4.4.7 不溶性底物水解進(jìn)程的測定105-106
• 4.4.8 熱力學(xué)穩(wěn)定性分析106
• 4.5 小結(jié)106-108
• 4.6 參考文獻(xiàn)108-111
• 創(chuàng)新點111-113
• 展望113-115
• 攻讀博士期間成果115-117
• 致謝117

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