本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌中與核糖體相關(guān)的GTP酶EngA的結(jié)構(gòu)與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：核糖體是生物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)的大分子機(jī)器。核糖體的組裝是一個(gè)復(fù)雜的過程。這個(gè)過程涉及大量功能不同的因子,包括多個(gè)ATP依賴的RNA螺旋酶和GTP酶。許多與核糖體相互作用的GTP酶除了參與核糖體組裝外,還被認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)節(jié)核糖體組裝和多個(gè)生長(zhǎng)控制通路的耦合點(diǎn)。EngA是細(xì)菌中的一個(gè)必需的GTP酶。它擁有兩個(gè)連續(xù)的GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在所有已知的GTP酶中它被單獨(dú)分為一類。在細(xì)菌中,50S核糖體大亞基的成熟需要EngA的存在。但是,EngA在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制目前還不十分清楚。本論文采用生物化學(xué)方法、電子顯微學(xué)和單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)研究了EngA蛋白和核糖體大亞基結(jié)合的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及它們的相互作用。本論文得到EngA蛋白和核糖體大亞基在GMPPNP和GDP兩種核酸狀態(tài)下的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)顯示EngA在兩個(gè)不同的核酸狀態(tài)在核糖體大亞基上有兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn),這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分別是核糖體大亞基上的兩個(gè)功能中心。當(dāng)存在GTP的類似物GMPPNP的條件下,EngA結(jié)合在核糖體大亞基上的多肽轉(zhuǎn)移酶活性中心,并使23S rRNA發(fā)生了巨大的構(gòu)象變化。它使核糖體大亞基的構(gòu)象變得很像核糖體大亞基組裝過程晚期的中間體。同時(shí),在EngA-50S-GMPPNP復(fù)合體中,EngA的兩個(gè)GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榧俣螌?duì)稱結(jié)構(gòu)。當(dāng)存在GDP的條件下,EngA結(jié)合在核糖體大亞基的多肽鏈出口的位置,該位置與許多新生肽鏈結(jié)合因子在核糖體上的結(jié)合位點(diǎn)是重合的。本論文還用生物化學(xué)方法研究了EngA蛋白和成熟核糖體大亞基的相互作用。研究顯示在成熟的核糖體大亞基存在的條件下,EngA的GTP酶活性增強(qiáng)。這有可能是通過使EngA的兩個(gè)GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生結(jié)構(gòu)重排達(dá)到的。最后,本論文研究了EngA蛋白和兩種不成熟的核糖體大亞基的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)EngA蛋白和△rrm J菌株中不成熟的核糖體大亞基的結(jié)合效率較高。這些研究表明某種特定構(gòu)象的不成熟的核糖體大亞基有可能是EngA作用的真正底物。本論文提供了EngA與核糖體大亞基相互作用的重要的結(jié)構(gòu)信息,并對(duì)EngA的功能進(jìn)行了一定研究,對(duì)于最終揭示EngA的作用機(jī)制具有非常重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：EngA Der YphC 核糖體組裝 GTP酶
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 主要符號(hào)對(duì)照表6-10
• 第1章 引言10-35
• 1.1 核糖體10-15
• 1.1.1 核糖體概述10
• 1.1.2 核糖體的研究歷史10-11
• 1.1.3 核糖體的結(jié)構(gòu)11-13
• 1.1.4 核糖體的功能13-15
• 1.2 核糖體的組裝過程15-23
• 1.2.1 rRNA的轉(zhuǎn)錄15-18
• 1.2.2 rRNA的修飾18
• 1.2.3 核糖體蛋白的修飾18-19
• 1.2.4 核糖體亞基的組裝19-23
• 1.3 核糖體組裝相關(guān)因子23-24
• 1.4 核糖體組裝相關(guān)GTP酶24-27
• 1.4.1 Era24-25
• 1.4.2 RsgA25-26
• 1.4.3 ObgE26
• 1.4.4 YihA26-27
• 1.5 ENGA27-31
• 1.5.1 概述27
• 1.5.2 EngA的結(jié)構(gòu)27-29
• 1.5.3 EngA的兩個(gè)GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域29
• 1.5.4 EngA的功能29-31
• 1.6 電子顯微學(xué)31-33
• 1.6.1 電子顯微鏡的簡(jiǎn)介31-32
• 1.6.2 單顆粒三維重構(gòu)的基本原理32-33
• 1.6.3 單顆粒三維重構(gòu)的新進(jìn)展33
• 1.7 本研究的意義33-35
• 第2章 EngA與核糖體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究35-70
• 2.1 材料與方法35-48
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器35-36
• 2.1.2 化學(xué)試劑36
• 2.1.3 宿主和載體36
• 2.1.4 野生型EngA以及各突變體的表達(dá)純化36-37
• 2.1.5 大腸桿菌核糖體的提取37-39
• 2.1.6 共沉淀實(shí)驗(yàn)39
• 2.1.7 電子顯微鏡樣品制備39-40
• 2.1.8 鍍碳膜40-41
• 2.1.9 冷凍樣品制樣過程41-42
• 2.1.10 用電子顯微鏡收集數(shù)據(jù)42-44
• 2.1.11 數(shù)據(jù)的三維重構(gòu)44-45
• 2.1.12 原子模型搭建45
• 2.1.13 EngA突變體的構(gòu)建45-48
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-69
• 2.2.1 大腸桿菌EngA蛋白的表達(dá)與純化48-50
• 2.2.2 50S核糖體的提取50-52
• 2.2.3 EngA與 50S核糖體的結(jié)合52-53
• 2.2.4 50S?EngA?GMPPNP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征53-59
• 2.2.5 50S?EngA?GDP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征59-65
• 2.2.6 用生物化學(xué)方法驗(yàn)證EngA和 50S復(fù)合物的結(jié)構(gòu)65-69
• 2.3 本章小結(jié)69-70
• 第3章 EngA與成熟核糖體大亞基的相互作用70-85
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法70-78
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料70
• 3.1.2 體外翻譯實(shí)驗(yàn)70
• 3.1.3 70S核糖體拆分實(shí)驗(yàn)70-71
• 3.1.4 EngA的定點(diǎn)突變和截短71-76
• 3.1.5 GTP酶活性檢測(cè)76-78
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果78-84
• 3.2.1 加入EngA使體外翻譯系統(tǒng)的翻譯效率降低78-80
• 3.2.2 EngA不拆分 70S核糖體80-81
• 3.2.3 his-tag對(duì)EngA的影響81-82
• 3.2.4 50S核糖體使EngA的GTP酶活性增強(qiáng)82-83
• 3.2.5 EngA的兩個(gè)GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的GTP酶活性的研究83-84
• 3.3 本章小結(jié)84-85
• 第4章 EngA與不成熟核糖體大亞基的相互作用85-97
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法85-89
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料85
• 4.1.2 YM01菌株不成熟核糖體大亞基的提取85-86
• 4.1.3 BW25113菌株上rrmJ基因的敲除86-87
• 4.1.4 △rrmJ菌株不成熟核糖體大亞基的提取87-88
• 4.1.5 Spot assay88
• 4.1.6 Ribosome profile88-89
• 4.2 結(jié)果與討論89-96
• 4.2.1 EngA與枯草芽孢桿菌YM01菌株中不成熟核糖體大亞基的相互作用89-90
• 4.2.2 EngA與大腸桿菌△rrmJ菌株中不成熟核糖體大亞基的相互作用90-96
• 4.3 本章小結(jié)96-97
• 第5章 討論與展望97-103
• 5.1 討論97-101
• 5.1.1 EngA在GAD家族中是一個(gè)單獨(dú)的成員97-99
• 5.1.2 EngA在核糖體組裝過程中的作用99-100
• 5.1.3 EngA有可能在脅迫條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)100-101
• 5.2 展望101-103
• 參考文獻(xiàn)103-115
• 致謝115-117
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果117

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本文編號(hào)：260432