本文關鍵詞：大腸桿菌中與核糖體相關的GTP酶EngA的結構與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：核糖體是生物體內合成蛋白質的大分子機器。核糖體的組裝是一個復雜的過程。這個過程涉及大量功能不同的因子,包括多個ATP依賴的RNA螺旋酶和GTP酶。許多與核糖體相互作用的GTP酶除了參與核糖體組裝外,還被認為是細胞調節(jié)核糖體組裝和多個生長控制通路的耦合點。EngA是細菌中的一個必需的GTP酶。它擁有兩個連續(xù)的GTP結合結構域,在所有已知的GTP酶中它被單獨分為一類。在細菌中,50S核糖體大亞基的成熟需要EngA的存在。但是,EngA在細胞內的作用機制目前還不十分清楚。本論文采用生物化學方法、電子顯微學和單顆粒三維重構技術研究了EngA蛋白和核糖體大亞基結合的復合物的結構以及它們的相互作用。本論文得到EngA蛋白和核糖體大亞基在GMPPNP和GDP兩種核酸狀態(tài)下的冷凍電鏡結構。這兩個結構顯示EngA在兩個不同的核酸狀態(tài)在核糖體大亞基上有兩個不同的結合位點,這兩個結合位點分別是核糖體大亞基上的兩個功能中心。當存在GTP的類似物GMPPNP的條件下,EngA結合在核糖體大亞基上的多肽轉移酶活性中心,并使23S rRNA發(fā)生了巨大的構象變化。它使核糖體大亞基的構象變得很像核糖體大亞基組裝過程晚期的中間體。同時,在EngA-50S-GMPPNP復合體中,EngA的兩個GTP結合結構域為假二次對稱結構。當存在GDP的條件下,EngA結合在核糖體大亞基的多肽鏈出口的位置,該位置與許多新生肽鏈結合因子在核糖體上的結合位點是重合的。本論文還用生物化學方法研究了EngA蛋白和成熟核糖體大亞基的相互作用。研究顯示在成熟的核糖體大亞基存在的條件下,EngA的GTP酶活性增強。這有可能是通過使EngA的兩個GTP結合結構域發(fā)生結構重排達到的。最后,本論文研究了EngA蛋白和兩種不成熟的核糖體大亞基的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)EngA蛋白和△rrm J菌株中不成熟的核糖體大亞基的結合效率較高。這些研究表明某種特定構象的不成熟的核糖體大亞基有可能是EngA作用的真正底物。本論文提供了EngA與核糖體大亞基相互作用的重要的結構信息,并對EngA的功能進行了一定研究,對于最終揭示EngA的作用機制具有非常重要的意義。
【關鍵詞】：EngA Der YphC 核糖體組裝 GTP酶
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 主要符號對照表6-10
• 第1章 引言10-35
• 1.1 核糖體10-15
• 1.1.1 核糖體概述10
• 1.1.2 核糖體的研究歷史10-11
• 1.1.3 核糖體的結構11-13
• 1.1.4 核糖體的功能13-15
• 1.2 核糖體的組裝過程15-23
• 1.2.1 rRNA的轉錄15-18
• 1.2.2 rRNA的修飾18
• 1.2.3 核糖體蛋白的修飾18-19
• 1.2.4 核糖體亞基的組裝19-23
• 1.3 核糖體組裝相關因子23-24
• 1.4 核糖體組裝相關GTP酶24-27
• 1.4.1 Era24-25
• 1.4.2 RsgA25-26
• 1.4.3 ObgE26
• 1.4.4 YihA26-27
• 1.5 ENGA27-31
• 1.5.1 概述27
• 1.5.2 EngA的結構27-29
• 1.5.3 EngA的兩個GTP結合結構域29
• 1.5.4 EngA的功能29-31
• 1.6 電子顯微學31-33
• 1.6.1 電子顯微鏡的簡介31-32
• 1.6.2 單顆粒三維重構的基本原理32-33
• 1.6.3 單顆粒三維重構的新進展33
• 1.7 本研究的意義33-35
• 第2章 EngA與核糖體復合物的結構研究35-70
• 2.1 材料與方法35-48
• 2.1.1 實驗儀器35-36
• 2.1.2 化學試劑36
• 2.1.3 宿主和載體36
• 2.1.4 野生型EngA以及各突變體的表達純化36-37
• 2.1.5 大腸桿菌核糖體的提取37-39
• 2.1.6 共沉淀實驗39
• 2.1.7 電子顯微鏡樣品制備39-40
• 2.1.8 鍍碳膜40-41
• 2.1.9 冷凍樣品制樣過程41-42
• 2.1.10 用電子顯微鏡收集數(shù)據(jù)42-44
• 2.1.11 數(shù)據(jù)的三維重構44-45
• 2.1.12 原子模型搭建45
• 2.1.13 EngA突變體的構建45-48
• 2.2 實驗結果48-69
• 2.2.1 大腸桿菌EngA蛋白的表達與純化48-50
• 2.2.2 50S核糖體的提取50-52
• 2.2.3 EngA與 50S核糖體的結合52-53
• 2.2.4 50S?EngA?GMPPNP復合物的結構特征53-59
• 2.2.5 50S?EngA?GDP復合物的結構特征59-65
• 2.2.6 用生物化學方法驗證EngA和 50S復合物的結構65-69
• 2.3 本章小結69-70
• 第3章 EngA與成熟核糖體大亞基的相互作用70-85
• 3.1 實驗材料與方法70-78
• 3.1.1 實驗材料70
• 3.1.2 體外翻譯實驗70
• 3.1.3 70S核糖體拆分實驗70-71
• 3.1.4 EngA的定點突變和截短71-76
• 3.1.5 GTP酶活性檢測76-78
• 3.2 實驗結果78-84
• 3.2.1 加入EngA使體外翻譯系統(tǒng)的翻譯效率降低78-80
• 3.2.2 EngA不拆分 70S核糖體80-81
• 3.2.3 his-tag對EngA的影響81-82
• 3.2.4 50S核糖體使EngA的GTP酶活性增強82-83
• 3.2.5 EngA的兩個GTP結合結構域的GTP酶活性的研究83-84
• 3.3 本章小結84-85
• 第4章 EngA與不成熟核糖體大亞基的相互作用85-97
• 4.1 實驗材料與方法85-89
• 4.1.1 實驗材料85
• 4.1.2 YM01菌株不成熟核糖體大亞基的提取85-86
• 4.1.3 BW25113菌株上rrmJ基因的敲除86-87
• 4.1.4 △rrmJ菌株不成熟核糖體大亞基的提取87-88
• 4.1.5 Spot assay88
• 4.1.6 Ribosome profile88-89
• 4.2 結果與討論89-96
• 4.2.1 EngA與枯草芽孢桿菌YM01菌株中不成熟核糖體大亞基的相互作用89-90
• 4.2.2 EngA與大腸桿菌△rrmJ菌株中不成熟核糖體大亞基的相互作用90-96
• 4.3 本章小結96-97
• 第5章 討論與展望97-103
• 5.1 討論97-101
• 5.1.1 EngA在GAD家族中是一個單獨的成員97-99
• 5.1.2 EngA在核糖體組裝過程中的作用99-100
• 5.1.3 EngA有可能在脅迫條件下調節(jié)細胞生長100-101
• 5.2 展望101-103
• 參考文獻103-115
• 致謝115-117
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果117

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2 孟飛;劉利;楊海芳;胥保華;郭興啟;;中華蜜蜂核糖體蛋白L17基因(AccRPL17)的克隆及其原核表達[A];山東生物化學與分子生物學會2009年學術會議論文匯編[C];2009年

3 徐文岳;黃復生;張敬如;段建華;;大劣按蚊血細胞核糖體蛋白部分S7cDNA克隆[A];昆蟲與環(huán)境——中國昆蟲學會2001年學術年會論文集[C];2001年

4 葉嘉良;張耀洲;;泛素-核糖體蛋白S27a的克隆及表達研究[A];華東六省一市生物化學與分子生物學學會2006年學術交流會論文集[C];2006年

5 邵漧柱;李家明;灻，

本文編號：260432