本文關(guān)鍵詞：綜合應(yīng)用核磁共振和順磁共振的大腸桿菌跨膜蛋白硫氰酸酶YgaP結(jié)構(gòu)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本論文中,我們通過(guò)應(yīng)用液體核磁共振和位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記的電子順磁共振技術(shù)研究了大腸桿菌蛋白YgaP的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特征。論文共分為四個(gè)部分。 第一章簡(jiǎn)要介紹了硫氰酸酶超家族蛋白。首先闡述了硫氰酸酶超家族的催化機(jī)制,并按照其結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)分為了四類,還對(duì)硫氰酸酶超家族所行使的解毒,生物大分子的合成,調(diào)控細(xì)胞周期等功能做了具體的描述。 第二章介紹了電子順磁共振的基本理論及其在生物學(xué)方面的應(yīng)用。簡(jiǎn)要描述了常用的自旋標(biāo)記物和位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記技術(shù)。通過(guò)在蛋白中引入自旋標(biāo)記物,利用電子順磁共振技術(shù),可以得到蛋白具體位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)方面的信息。數(shù)據(jù)的分析主要集中在動(dòng)力學(xué)參數(shù),易趨性和距離信息這三個(gè)方面,并且通過(guò)實(shí)例印證了順磁電子共振在研究蛋白結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化上的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。還簡(jiǎn)要說(shuō)明了電子順磁共振在生物自由基和細(xì)胞膜中的應(yīng)用。 第三章介紹了大腸桿菌蛋白YgaP的溶液結(jié)構(gòu)研究。我們通過(guò)核磁共振技術(shù)解析了YgaP硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu),并與大腸桿菌中其他硫氰酸酶蛋白G1pE和PspE作比較,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上的相似性。隨后通過(guò)Na2S2O3滴定的方法,研究了YgaP與底物之間的相互作用。通過(guò)化學(xué)位移的擾動(dòng),確定了其活性位點(diǎn)loop形成的底物結(jié)合口袋,以及在酶促反應(yīng)的第一步時(shí)底物與酶的結(jié)合過(guò)程在NMR時(shí)間尺度上為快交換過(guò)程。并且由Ala66和Asn72的化學(xué)位移的變化得到了解離常數(shù)Kd的值。 第四章首先簡(jiǎn)要描述了利用電子順磁共振解析膜蛋白結(jié)構(gòu)信息。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)半胱氨酸掃描法,逐點(diǎn)標(biāo)記YgaP跨膜區(qū)的45個(gè)氨基酸位點(diǎn),利用電子順磁共振技術(shù)研究其易趨性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通過(guò)數(shù)據(jù)分析,得知在DPC膠束中,YgaP以同源二聚體的形式存在。根據(jù)標(biāo)記位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)和易趨性以3.6為一個(gè)周期的波動(dòng)的特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)了其跨膜區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)為兩跨膜的α螺旋。確定了YgaP跨膜區(qū)的起始和結(jié)束位置及跨膜螺旋的相互作用的接觸面,并結(jié)合測(cè)量所得的距離信息,搭建出了YgaP跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)模型。并且結(jié)合YgaP硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域的溶液NMR結(jié)構(gòu),利用CW-EPR和DEER所得的距離約束得到了全長(zhǎng)的YgaP的結(jié)構(gòu)模型。
【關(guān)鍵詞】：硫氰酸酶 核磁共振 電子順磁共振 位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記 易趨性滴定 快交換 結(jié)構(gòu)模型
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 目錄8-12
• 第一章 硫氰酸酶的結(jié)構(gòu)和功能簡(jiǎn)介12-24
• 1.1 前言12-13
• 1.2 硫氰酸酶的催化機(jī)制13-14
• 1.3 硫氰酸酶同源結(jié)構(gòu)域14-15
• 1.4 硫氰酸酶的分類15-17
• 1.4.1 串聯(lián)結(jié)構(gòu)域蛋白15
• 1.4.2 單一結(jié)構(gòu)域蛋白15-16
• 1.4.3 復(fù)合結(jié)構(gòu)域蛋白16-17
• 1.4.4 長(zhǎng)活性位點(diǎn)蛋白17
• 1.5 硫氰酸酶的生物學(xué)功能17-22
• 1.5.1 氰化物解毒作用18-19
• 1.5.2 硫胺和硫脲苷的合成19-20
• 1.5.3 鉬蛋白輔助因子的合成20-21
• 1.5.4 含硒生物大分子的合成21
• 1.5.5 調(diào)控細(xì)胞周期21-22
• 1.5.6 硫氰酸酶的其他功能22
• 1.6 硫氰酸酶超家族研究的展望22-24
• 第二章 電子順磁共振基本理論及在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用24-44
• 2.1 前言24
• 2.2 電子順磁共振基本原理及譜儀簡(jiǎn)介24-27
• 2.2.1 電子順磁共振基本原理24-25
• 2.2.2 電子順磁共振譜儀25-26
• 2.2.3 信號(hào)收集時(shí)儀器參數(shù)26-27
• 2.3 自旋標(biāo)記技術(shù)27-29
• 2.3.1 自旋標(biāo)記物27-28
• 2.3.2 位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記(SDSL)28-29
• 2.4 從SDSL-EPR得到的主要信息29-35
• 2.4.1 動(dòng)力學(xué)信息(motion)30-32
• 2.4.2 溶劑易趨性(Accessibilty)32-33
• 2.4.3 距離信息33-35
• 2.5 SDSL-EPR在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用35-41
• 2.5.1 通過(guò)動(dòng)力學(xué)和易趨性信息確定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)35-37
• 2.5.2 蛋白的入膜深度37-38
• 2.5.3 檢測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化38-41
• 2.6 在生物學(xué)其他方面的應(yīng)用41-42
• 2.7 小結(jié)42-44
• 第三章 大腸桿菌YgaP的硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)及功能研究44-72
• 3.1 前言44-46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法46-60
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)46-47
• 3.2.2 PCR反應(yīng)47-48
• 3.2.3 PCR產(chǎn)物的鑒定和回收48
• 3.2.4 雙酶切反應(yīng)48-49
• 3.2.5 連接反應(yīng)49-50
• 3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化50
• 3.2.7 菌落PCR和雙酶切鑒定50-51
• 3.2.8 蛋白表達(dá)條件的篩選51-52
• 3.2.9 YgaP(1-107)的表達(dá)52
• 3.2.10 YgaP(1-107)蛋白純化及核磁樣品的制備52-53
• 3.2.11 核磁實(shí)驗(yàn)53
• 3.2.12 主鏈歸屬53-56
• 3.2.13 側(cè)鏈原子的化學(xué)位移歸屬56-58
• 3.2.14 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及二面角約58
• 3.2.15 距離約束信息58-59
• 3.2.16 Na_2S_2O_3和NaSCN滴定59-60
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論60-69
• 3.3.1 YgaP硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域的化學(xué)位移歸屬60-61
• 3.3.2 Talos+二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)61-62
• 3.3.3 YgaP(1-107)的溶液結(jié)構(gòu)62-66
• 3.3.4 硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)比對(duì)66
• 3.3.5 Na_2S_2O_3和NaSCN滴定實(shí)驗(yàn)66-69
• 3.4 小結(jié)69-72
• 第四章 利用電子順磁共振技術(shù)解析YgaP跨膜區(qū)拓?fù)淠Ｐ?/span>72-96
• 4.1 引言72-73
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法73-83
• 4.2.1 YgaP蛋白序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)73-74
• 4.2.2 位點(diǎn)突變74-75
• 4.2.3 YgaP的表達(dá)75
• 4.2.4 YgaP的融膜去污劑的篩選75-76
• 4.2.5 蛋白純化及洗脫去污劑的篩選76
• 4.2.6 用分子篩純化蛋白76-77
• 4.2.7 突變位點(diǎn)的MTSL標(biāo)記77
• 4.2.8 圓二色譜實(shí)驗(yàn)77-78
• 4.2.9 連續(xù)波EPR實(shí)驗(yàn)78
• 4.2.10 功率飽和EPR實(shí)驗(yàn)78-79
• 4.2.11 DEER光譜收集79-80
• 4.2.12 CW-EPR及DEER的光譜處理及距離擬合80-82
• 4.2.13 距離數(shù)據(jù)處理82
• 4.2.14 YgaP剛性結(jié)構(gòu)模型的搭建82-83
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論83-93
• 4.3.1 YgaP的表達(dá)純化83-85
• 4.3.2 YgaP跨膜區(qū)的動(dòng)力學(xué)特性85-87
• 4.3.3 YgaP跨膜區(qū)的易趨性特征87-89
• 4.3.4 YgaP跨膜區(qū)的距離信息及結(jié)構(gòu)模型建立89-93
• 4.4 小結(jié)93-96
• 參考文獻(xiàn)96-106
• 附錄106-110
• 致謝110-111
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的研究成果111

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 王碩;于佳一;李惟;李菲;;SDS膠束溶液中Exendin-4活性類似物結(jié)構(gòu)分析[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2011年04期

2 洪晶;郭晨云;劉華;梁愛(ài)華;林東海;汪少蕓;;八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白的核磁共振研究[J];福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年06期

3 黃飛娟;杜為紅;王保懷;;含有D型氨基酸的新型毒肽——芋螺馬芬在pH5的溶液結(jié)構(gòu)(英文)[J];物理化學(xué)學(xué)報(bào);2008年09期

4 趙興旺;劉冉冉;鄭麥青;文杰;陳繼蘭;趙桂蘋(píng);;雞MyD88-TIR的同源模建[J];生物信息學(xué);2011年04期

5 段紹瑾;;Application of Theories of Free Radicals and Electron Spin Resonance for Research of Traditional Chinese Medicine[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2000年01期

6 劉忠超;張文藝;王亮;張海英;崔松野;阮書(shū)洲;焦玲;;血清白蛋白電子自旋共振波譜在腫瘤診斷中的應(yīng)用[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2013年10期

7 朱超;解井坤;花莉;楊冰;沈爍;;產(chǎn)自Bacillus sp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶結(jié)構(gòu)模型研究[J];陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年06期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉長(zhǎng)東;Cdt1結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Mcm6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的NMR結(jié)構(gòu)研究[D];華東師范大學(xué);2011年

2 姚文明;用多維核磁共振技術(shù)研究人去甲基化酶JARID1B-ARID的溶液結(jié)構(gòu)及其與DNA的相互作用[D];華東師范大學(xué);2011年

3 紀(jì)鵬;人類ZO-1蛋白第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)與功能[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2010年

4 吳芳明;釀酒酵母蛋白Prp20p以及人源鋅指蛋白DESR1的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2010年

5 王碩;兩種多肽類藥物結(jié)構(gòu)的譜學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2011年

6 彭恒;多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原結(jié)構(gòu)與免疫保護(hù)作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

7 姚向陽(yáng);牛蒡子苷元抗腫瘤的分子機(jī)制研究[D];南京師范大學(xué);2011年

8 王玨;PAK家族蛋白的自激活調(diào)控機(jī)制[D];清華大學(xué);2010年

9 徐國(guó)華;抗菌肽HEDISTIN和二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W21H的結(jié)構(gòu)及生物作用機(jī)制研究[D];華中師范大學(xué);2011年

10 范楷;肺炎鏈球菌HtrA蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域和嗜鹽古菌SAMPs蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：綜合應(yīng)用核磁共振和順磁共振的大腸桿菌跨膜蛋白硫氰酸酶YgaP結(jié)構(gòu)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：259879