本文關(guān)鍵詞：大麗輪枝菌分泌蛋白質(zhì)組學(xué)及酵母同源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大麗輪枝菌是廣泛分布在土壤中的一種病原真菌,可以引起植物黃萎病,在全世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大麗輪枝菌不但可以讓植物葉片大面積發(fā)黃褪色,更為嚴(yán)重的是可以入侵到植物體內(nèi),堵塞導(dǎo)管和維管束,最后造成植物壞死和腐爛。但是,目前還未發(fā)現(xiàn)有效根治黃萎病的方法,對(duì)大麗輪枝菌如何入侵植物體內(nèi)的理解不夠清晰,對(duì)宿主植物和大麗輪枝菌的具體互作機(jī)制也不清楚,大麗輪枝菌毒力相關(guān)蛋白的功能研究也還處在初步階段。 有文獻(xiàn)報(bào)道,病原真菌在低氮的環(huán)境條件下入侵植物,很多與病原真菌毒力有關(guān)的激發(fā)子蛋白迅速誘導(dǎo)表達(dá),這也和病原真菌入侵植物時(shí)面臨的營養(yǎng)缺乏時(shí)氮源利用相關(guān)基因的大量表達(dá)是相似的。營養(yǎng)壓力,特別是低氮限制的壓力也被證明是影響病原真菌生長和發(fā)育最關(guān)鍵的因素之一。總之,當(dāng)病原真菌入侵植物時(shí),植物內(nèi)環(huán)境對(duì)真菌而言是一個(gè)氮源限制的環(huán)境,或者說在體外可以通過氮源限制來模擬病原真菌入侵植物時(shí)的內(nèi)部環(huán)境。 在致病菌與植物的相互作用過程中涉及到眾多的信號(hào)分子的識(shí)別與傳導(dǎo)。其中,真菌的分泌蛋白在這個(gè)過程中起著不可或缺的作用。事實(shí)上,這些病原真菌的致病性因子和激發(fā)子蛋白都是需要分泌到細(xì)胞外才能行使其生物學(xué)功能。 近年來,隨著基因組測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展,大量植物病原菌基因組的序列被測(cè)定,因此利用這些數(shù)據(jù)庫平臺(tái)并借助蛋白質(zhì)組學(xué)的方法可以鑒定這些病原菌中的關(guān)鍵毒力因子蛋白。我們利用凝膠電泳后切膠回收和直接在溶液中進(jìn)行酶解兩種方法,并結(jié)合多維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)研究了大麗輪枝菌在低氮限制條件下分泌的蛋白質(zhì)組。我們共鑒定出214個(gè)蛋白質(zhì),通過序列分析和GO(Gene Ontology)基因功能注釋,發(fā)現(xiàn)它們包括與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的10類蛋白、與分子功能相關(guān)的8類蛋白以及參與生物過程處理的19類蛋白。通過細(xì)胞定位的分析,我們篩選出33種分泌蛋白,這些蛋白的等電點(diǎn)分布從4.56到9.51,分子量為13-86kDa。結(jié)合NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)和GO基因功能注釋,可以將這些分泌蛋白大致分為6大類型：激發(fā)子蛋白和免疫原性蛋白、降解/重建細(xì)胞壁相關(guān)酶類、蛋白酶和酯酶類、能量代謝和蛋白代謝調(diào)控蛋白、氧化還原酶類、未知功能蛋白。降解／重建細(xì)胞壁相關(guān)酶類負(fù)責(zé)突破植物細(xì)胞壁屏障,激發(fā)子蛋白以及免疫原性蛋白會(huì)啟動(dòng)植物的免疫反應(yīng),其他一些代謝相關(guān)蛋白負(fù)責(zé)消除入侵過程中的氧化壓力和營養(yǎng)限制,保證自身的營養(yǎng)供給和能量來源,最終完成侵染植物的過程。 我們對(duì)分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為鑒定大麗輪枝菌的毒力因子奠定了基礎(chǔ),并為進(jìn)一步研究黃萎病的生物防治提供了理論指導(dǎo)。 同時(shí),我們對(duì)上述的一個(gè)分泌蛋白磷脂酰甘油/磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PG/PTTP)釀酒酵母中的同源蛋白Npc2在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá),并利用親和層析和分子篩的方法純化了該蛋白,進(jìn)行了晶體初篩和優(yōu)化實(shí)驗(yàn),已收集一套3.3A分辨率的X射線衍射數(shù)據(jù)。 此外,我們還對(duì)蘇云金芽孢桿菌CrylAa質(zhì)粒進(jìn)行了單點(diǎn)突變工作,獲得了CrylAa的單點(diǎn)突變蛋白(CrylAa H168R,CrylAa N372G和CrylAa N372A),通過細(xì)胞學(xué)快速檢測(cè)方法,獲得提高CrylAa殺蟲活性的有效方法。
【關(guān)鍵詞】：大麗輪枝菌 蛋白質(zhì)組 低氮限制 分泌蛋白 釀酒酵母 Npc2 重組蛋白 Cry1Aa 殺蟲蛋白 單點(diǎn)突變
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一部分 大麗輪枝菌分泌蛋白組學(xué)研究12-56
• 第一章 大麗輪枝菌的研究背景12-24
• 1.1 引言12-13
• 1.2 氮信號(hào)對(duì)植物病原真菌的意義13-14
• 1.3 真菌分泌蛋白的作用14-19
• 1.3.1 激發(fā)子蛋白15-16
• 1.3.2 降解植物細(xì)胞壁以及消化真菌自己細(xì)胞壁的酶類16-18
• 1.3.3 毒素蛋白18-19
• 1.4 宿主植物對(duì)大麗輪枝菌病原菌分泌蛋白的響應(yīng)19-21
• 1.5 植物致病真菌的蛋白組學(xué)、分泌蛋白組學(xué)研究進(jìn)展21-24
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與方法24-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備24-25
• 2.1.1 菌株與主要試劑24
• 2.1.2 儀器設(shè)備24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.2.1 大麗輪枝菌平臺(tái)期時(shí)間的摸索25
• 2.2.2 大麗輪枝菌的低氮處理25
• 2.2.3 大麗輪枝菌的分泌蛋白提取25
• 2.2.4 大麗輪枝菌的梯度膠電泳25-26
• 2.2.5 大麗輪枝菌分泌蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的樣品前處理及步驟26-27
• 2.2.6 大麗輪枝菌分泌蛋白的篩選和鑒定27-28
• 第三章 結(jié)果與討論28-42
• 3.1 大麗輪枝菌在正常培養(yǎng)條件下和低氮限制條件下的生物量變化28
• 3.2 質(zhì)譜鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和二次篩選后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-42
• 3.2.1 質(zhì)譜鑒定的蛋白GO分類功能分析29-31
• 3.2.2 鑒定的低氮條件下誘導(dǎo)的分泌蛋白理化性質(zhì)分析31-32
• 3.2.3 鑒定的低氮條件下誘導(dǎo)的分泌蛋白功能分析32-40
• 3.2.4 可能的侵入過程40-42
• 本篇小結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-56
• 第二部分 釀酒酵母Npc2蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究56-84
• 第四章 Npc2蛋白的研究背景56-62
• 4.1 引言56
• 4.2 Npc2基因的鑒定56-57
• 4.3 Npc2蛋白的功能分析57-62
• 4.3.1 釀酒酵母中Npc2蛋白的功能分析58
• 4.3.2 哺乳動(dòng)物中Npc2蛋白的功能分析及其可能的機(jī)制58-62
• 第五章 實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與方法62-74
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備62-63
• 5.1.1 質(zhì)粒、菌株62
• 5.1.2 酶類、其他試劑62
• 5.1.3 儀器設(shè)備62-63
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法63-74
• 5.2.1 酵母Npc2重組質(zhì)粒的構(gòu)建63-67
• 5.2.2 目的蛋白的表達(dá)與純化條件摸索67-70
• 5.2.3 蛋白質(zhì)晶體的初篩及其優(yōu)化方法70-74
• 第六章 結(jié)果與討論74-80
• 6.1 Npc2蛋白的表達(dá)與純化74-76
• 6.1.1 Npc2蛋白的表達(dá)74
• 6.1.2 Npc2蛋白的純化74-76
• 6.2 Npc2蛋白的晶體學(xué)結(jié)果76-78
• 6.2.1 Npc2蛋白晶體的生長與優(yōu)化條件76-77
• 6.2.2 Npc2衍射數(shù)據(jù)的收集及結(jié)果分析77-78
• 6.3 Npc2蛋白的序列比對(duì)分析78-80
• 本篇小結(jié)80-81
• 參考文獻(xiàn)81-84
• 第三部分 Cry1Aa突變蛋白的功能研究84-106
• 第七章 蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白的研究背景84-90
• 7.1 引言84
• 7.2 Cry蛋白的結(jié)構(gòu)分析84-90
• 7.2.1 Cry毒素蛋白作用機(jī)理85-87
• 7.2.2 影響Cry毒素蛋白殺蟲殺蟲活性的因素87-88
• 7.2.3 殺蟲晶體蛋白應(yīng)用研究進(jìn)展88-90
• 第八章 實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與方法90-98
• 8.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備90
• 8.1.1 質(zhì)粒、菌株90
• 8.1.2 酶類及其它試劑90
• 8.1.3 儀器設(shè)備90
• 8.2 實(shí)驗(yàn)方法90-98
• 8.2.1 Cry1Aa單點(diǎn)突變(H168R,N372G,N372A)突變質(zhì)粒的構(gòu)建90-95
• 8.2.2 蘇云金芽孢桿菌中的蛋白表達(dá)條件摸索95-96
• 8.2.3 Cry1Aa突變蛋白的表達(dá)條件摸索96
• 8.2.4 Cry1Aa突變蛋白的毒性檢測(cè)96-98
• 第九章 結(jié)果與討論98-102
• 9.1 Cry1Aa蛋白的純化結(jié)果98-99
• 9.2 Cry1Aa突變蛋白的毒力篩選結(jié)果99-101
• 9.2.1 Cry1Aa突變蛋白毒力的昆蟲細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法的建立99-101
• 9.3 Cry1Ac10蛋白的表達(dá)純化及晶體學(xué)結(jié)果101-102
• 本篇小結(jié)102-103
• 參考文獻(xiàn)103-106
• 附錄106-114
• 致謝114-116
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、取得的其他研究成果以及參加的學(xué)術(shù)會(huì)議116-117
• 附件117-139

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陶勇;金虹;龍章富;張麗;丁秀瓊;陶科;劉世貴;;一株Sanguibacter sp.C4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)(英文)[J];遺傳學(xué)報(bào);2006年11期

  本文關(guān)鍵詞：大麗輪枝菌分泌蛋白質(zhì)組學(xué)及酵母同源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：259364