【摘要】：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在真核細胞內(nèi)負責大部分蛋白質(zhì)的降解,在維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及參與基本的細胞活動中起著關(guān)鍵的作用。泛素分子在經(jīng)過泛素活化酶、泛素結(jié)合酶和泛素連接酶的依次作用下以共價連接的形式結(jié)合在蛋白質(zhì)底物上,特異多聚泛素化的蛋白質(zhì)底物最終被蛋白酶體識別并降解。26S蛋白酶體是個巨大的蛋白質(zhì)復(fù)合物,由至少32個不同的蛋白酶體亞基組裝而成。蛋白酶體組裝異常以及蛋白酶體活性的改變將影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和細胞的生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)磷酸酶 UBLCP1(Ubiquitin-like domain-containing C-terminal domain phosphatase 1)是FCP/SCP磷酸酶家族中的一員。近年來,UBLC.P1是首次被報道的蛋白酶體的磷酸酶。前人的研究發(fā)現(xiàn),UBLCP1可以與蛋白酶體的亞基Rpn1相互作用,并且在體外能去磷酸化蛋白酶體。但是,目前仍然不清楚UBLCP1對哪個蛋白酶體亞基進行去磷酸化,同時,也不清楚UBLCP1如何調(diào)控蛋白酶體活性。我們的研究工作顯示,UBLCP1可以通過結(jié)合Rpn1而選擇性地結(jié)合在蛋白酶體19S調(diào)節(jié)顆粒(RP)上,而不結(jié)合蛋白酶體20S核心顆粒(CP)或者完整的26S蛋白酶體。UBLCP1可以去磷酸化RP上的Rpt1亞基,并且能抑制Rpt1的ATP酶的活性,最終抑制蛋白酶體的組裝。我們的工作也發(fā)現(xiàn),UBLCP1對RP的組裝并沒有影響。UBLCP1能顯著地抑制蛋白酶體活性,并且能促進蛋白酶體底物的穩(wěn)定性。此外,我們還分別通過體內(nèi)和體外實驗證明,UBLCP1的磷酸酶活性對于調(diào)控Rpt1的磷酸化和蛋白酶體的活性至關(guān)重要。而敲減Rpn1能夠抑制UBLCP1與Rpt1的相互作用,并且抑制UBLCP1去磷酸化Rpt1和調(diào)控蛋白酶體的能力,說明UBLCP1調(diào)控蛋白酶體這一過程依賴于Rpn1。綜上所述,我們認為本研究揭示了 UBLCP1作為一個磷酸酶去磷酸化并調(diào)節(jié)蛋白酶體的具體機制。UBLCP1通過Rpn1與RP相互作用去磷酸化Rpt1,抑制Rpt1的ATP酶的活性,抑制蛋白酶體的組裝,并最終調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白酶體的活性。
【圖文】：

浙江大學(xué)博±學(xué)位論文邐窠一章后再與ｐ２７－Ｒｐｔ４－Ｒｐｔ５相互作用。最后，通過＂蓋子＂和＂基座＂的相互作用，成ＲＰ的組裝。在這個過程中，同樣需要Ｒｐｔｌ－６的ＡＴＰ酶活性（４９）。也有研究ＰＡＡＦ１、ｇａｎｋｙｒｉｎ／ｐ２８和Ｓ化能夠與組裝完成的ＲＰ相互作用，提示其在ＲＰ結(jié)合之前從蛋白酶體上解離下來。目前，ＲＰ上＂蓋子＂部分的}D裝過程仍然很清楚。逡逑ｔ化咐，Ｒｐ＂ｉ

疫沉淀產(chǎn)物中沒有發(fā)現(xiàn)任何ＣＰ亞基。我們進一步采用了免疫共沉淀的實驗方法進逡逑行驗證，發(fā)現(xiàn)ＨＡ標簽的ＵＢＬＣＰ１邋Ｗ及栜酸酶突變ＤＤＡＡ都可Ｗ與ＦＬＡＧ標簽的逡逑ＲＰ亞基進行相互作用。如圖３N１所示，在ＨＥＫ２９３Ｔ細胞里面，，ＵＢＬＣＰ１和ＤＤＡＡ逡逑都可Ｗ與ＦＬＡＧ標簽的蛋白酶體亞基Ｒｐｔｌ和Ｒｐｎｌ邋Ｗ及組裝分子伴侶ＰＡＡＦ１相互逡逑作用，但是不能與ＣＰ上的亞基（３４相互作用（圖３N１，泳道１１－１２）。逡逑ＨＡ－ＶｅｃｔＯＴ邐＋邐－邐—邐＋邐－邐—邐＋逡逑ＨＡ－ＵＢＬＣＰ１邐－邐＋邐－逡逑ＨＡ－ＤＤＡＡ邐－邐—邐牛邐－邐—邐牛邐－邐＿邐＋邐＋逡逑ＦＬＡＧ－Ｒｐｎ１邐＋邐＋邐＋邐－邐逡逑ＦＬＡＧ－Ｒｐｔ１邐－邐—邐－邐＋邐＋邐＋逡逑ＲＡＧ－ＰＡＡＦ１邐－邐－邐＋邐＋邐＋邐－逡逑ＦＬＡＧ－Ｐ４邋…邐＋邋＋邋＋逡逑。焌邋Ｊ邐二邐？邐．ｐ－邐１逡逑３邋３７－Ｉ邋＜ＷＷｎＢＩ｜｜邐邐ｊ－ＨＡ－ＵＢＬＣＰ１／ＤＤＡＡ逡逑＾邐＿邋ＦＬＡＧ－Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋Ｓｕｂｕｎｉｔｓ逡逑＿邐＾＊＊＾＾＊＊＾＾＊＾邐／Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ逡逑…化邋３７４邋？■＾ｌｌ邐r>ＩＷＰｌｆ邋ｗｍｍ邋ｌ－ＨＡ－ＵＢＬＣＰＩ／ＤＰＡＡ逡逑１邐２３４５邐壇邋７８９邐１０邋１１邐１２逡逑圖３．１．１邋ＵＢＬＣＰｌ與蛋白酶體亞基
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55

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本文編號：2578086