本文關(guān)鍵詞：煙草C3H2C3型RING蛋白NtRCP1的功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：泛素/26S蛋白酶途徑是真核生物中最重要的蛋白降解系統(tǒng)。泛素分子首先被連接到需要降解的蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上,然后被26S蛋白酶體識別并降解。整個泛素化過程依次由泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)介導(dǎo)完成,其中E3連接酶尤為重要,因其除了連接功能外還具有高度的底物識別特異性。RING(Really interesting new gene)蛋白是E3連接酶家族的重要成員,其種類繁多,功能涉及到植物整個生活史,包括種子的發(fā)育、葉片形態(tài)建成及花發(fā)育等,并且在應(yīng)答各種生物或非生物脅迫過程中發(fā)揮重要功能。迄今為止,擬南芥中已經(jīng)分離鑒定了多個RING蛋白家族成員,其細胞內(nèi)功能也不斷被揭示,而煙草中僅克隆鑒定了一個影響植株生長發(fā)育的C3HC4型RING蛋白。本論文利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)及反向遺傳學(xué)等方法對煙草BY-2細胞中一個C3H2C3型RING蛋白NtRCP1(Nicotiana tobacum RING-domain-containing protein1)的功能進行了分析鑒定,相關(guān)研究結(jié)果對于系統(tǒng)了解RING家族蛋白的生物學(xué)功能具有重要的科學(xué)意義。 NtRCP1是利用裂殖酵母體系篩選出的細胞分裂相關(guān)基因。酶活分析表明NtRCPl是一個有功能的E3連接酶,在E1和E2的存在下能夠催化泛素形成由高到低分子量梯度條帶。在煙草中過量表達NtRCP1能促進植株從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)基因煙草開花時間提前,而抑制該基因表達能夠在一定程度上推遲開花。細胞學(xué)分析顯示與野生型相比,過量表達NtRCP1的轉(zhuǎn)基因煙草莖頂端中分生組織細胞明顯增多,暗示NtRCP1能通過促進細胞分裂參與開花起動所需的形態(tài)建成。基因表達分析表明NtRCPl基因在煙草的各個組織器官中均有表達,根中略低,并且其在生殖生長階段的莖頂端分生組織中的表達量比營養(yǎng)生長階段明顯升高。在BY-2模式細胞中過量表達NtRCP1,分析其在細胞分裂周期中的功能,結(jié)果表明提高NtRCP1基因表達水平能促進細胞分裂,究其原因是由于細胞周期進程中的G2期縮短。這些研究結(jié)果暗示NtRCP1可能是煙草開花途徑的調(diào)控因子之一,在煙草從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡時期,NtRCP1可能通過泛素化降解某個控制G2至M期轉(zhuǎn)換的靶蛋白,促進莖頂端分生組織的細胞分裂及開花起始相關(guān)的形態(tài)建成,從而參與對開花時間的調(diào)控。 此外,由于許多RING蛋白既能參與植物生長發(fā)育也能參與應(yīng)答各種生物或非生物脅迫,而NtRCP1受非生物脅迫誘導(dǎo)表達,因此,對其在應(yīng)答環(huán)境脅迫中的功能進行了初步分析。結(jié)果表明在煙草中過量表達NtRCP1能夠減緩氧化脅迫傷害,而抑制NtRCP1表達則能增強傷害程度；與野生型相比,過量表達NtRCP1的煙草葉片中葉綠素下降減緩、丙二醛含量升高延緩,并且清除活性氧的抗壞血酸氧化酶活性下降相對緩慢。由此推測,NtRCP1可能通過參與調(diào)控抗氧化酶活性來維持逆境下細胞內(nèi)的活性氧平衡。 綜上所述,NtRCP1可能是煙草中一個具有雙重功能的RING蛋白,在調(diào)控植物從營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)換以及抵御外界非生物脅迫中發(fā)揮作用。相關(guān)的研究結(jié)果不僅能夠為煙草RING家族成員的理論研究增添實驗依據(jù),而且可望為煙草耐逆和生長周期調(diào)控分子育種提供目標基因。
【關(guān)鍵詞】：RING蛋白 細胞分裂 開花起始 非生物脅迫應(yīng)答 活性氧
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q946.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 主要縮寫9-11
• 第一章 文獻綜述11-33
• 1.1 E3連接酶的種類11-13
• 1.1.1 單亞基E3連接酶11-13
• 1.1.2 多亞基E3連接酶13
• 1.2 RING蛋白研究進展13-28
• 1.2.1 RING蛋白在細胞周期調(diào)控中的功能14-17
• 1.2.2 RING蛋白在植物營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)換中的功能17-20
• 1.2.3 RING在植物應(yīng)答非生物脅迫中的功能20-25
• 1.2.4 RING蛋白在植物應(yīng)答生物脅迫中的功能25-28
• 1.3 煙草開花機理研究進展28-32
• 1.3.1 煙草成花時期的細胞形態(tài)建成28-30
• 1.3.2 影響煙草開花的因素30-31
• 1.3.3 煙草成花的分子機制31-32
• 1.4 研究目的和意義32-33
• 第二章 實驗材料與方法33-43
• 2.1 實驗材料33
• 2.1.1 植物材料33
• 2.1.2 宿主菌及質(zhì)粒33
• 2.1.3 試劑33
• 2.1.4 植物培養(yǎng)材料33
• 2.2 儀器設(shè)備33-34
• 2.3 實驗方法34-43
• 2.3.1 基因克隆及植物表達載體構(gòu)建34
• 2.3.2 序列比對分析34
• 2.3.3 BY-2細胞培養(yǎng)及同步化34-35
• 2.3.4 植物種子消毒處理35
• 2.3.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物和細胞轉(zhuǎn)化35-36
• 2.3.6 DNA提取和PCR分析36-37
• 2.3.7 RNA提取和基因表達量分析37-38
• 2.3.8 NtRCP1融合蛋白的體外泛素化活性分析38
• 2.3.9 亞細胞定位觀察38-39
• 2.3.10 煙草BY-2細胞和植株的非生物脅迫分析39
• 2.3.11 葉綠素含量測定39
• 2.3.12 MDA含量測定39-40
• 2.3.13 葉綠素熒光分析40
• 2.3.14 抗氧化酶活性測定40-41
• 2.3.15 煙草莖頂端切片41
• 2.3.16 本論文所用引物41-43
• 第三章 NtRCP1在煙草生長發(fā)育中的功能43-53
• 3.1 NtRCP1的生化活性分析43-45
• 3.2 過量和抑制NtRCP1表達轉(zhuǎn)基因煙草的獲得和鑒定45-46
• 3.3 過量表達NtRCP1能夠促進煙草開花46-47
• 3.4 過量表達NtRCP1能夠促進莖頂端分生組織的細胞分裂47-49
• 3.5 NtRCP1在煙草組織器官中的表達分析49-50
• 3.6 過量表達NtRCP1的BY-2細胞表型分析50-53
• 第四章 NtRCP1在非生物脅迫應(yīng)答中的功能53-60
• 4.1 NtRCP1對非生物脅迫的應(yīng)答53-54
• 4.2 過量表達NtRCP1能夠提高煙草BY-2細胞對非生物脅迫的耐受性54-55
• 4.3 NtRCP1的表達變化沒有改變對鹽和干旱脅迫的耐受性55-56
• 4.4 過量表達NtRCP1能夠提高煙草的耐氧化能力56-59
• 4.5 NtRCP1的亞細胞定位59-60
• 第五章 討論60-64
• 5.1 NtRCP1轉(zhuǎn)錄水平的表達受多種因素誘導(dǎo)60
• 5.2 NtRCP1能夠通過調(diào)控細胞周期進程促進煙草開花60-61
• 5.3 NtRCP1可能通過調(diào)控抗氧化酶的活性提高煙草對氧化脅迫的耐受性61-62
• 5.4 NtRCP1可能是一個具有雙重功能的RING蛋白62-64
• 第六章 結(jié)論和展望64-84
• 6.1 結(jié)論64
• 6.2 展望64-65
• 參考文獻65-84
• 綜述84-94
• 參考文獻93-94
• 致謝94-95
• 作者簡歷95-96

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 全先慶,高文;鹽生植物活性氧的酶促清除機制[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年02期

2 趙江濤;李曉峰;李航;徐睿_

本文編號：255802