發(fā)布時間：2017-03-19 08:06

  本文關(guān)鍵詞：Apontic在果蠅器官發(fā)育過程中的功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：轉(zhuǎn)錄因子具有結(jié)合DNA的能力,在生物發(fā)育過程中通過調(diào)控靶基因的表達發(fā)揮重要作用。對轉(zhuǎn)錄因子下游基因的鑒定能夠很好地解釋其功能。Apontic(Apt)是在果蠅中發(fā)現(xiàn)并在果蠅胚胎時期的氣管、頭部、心臟、生殖細(xì)胞發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)形成等過程中發(fā)揮重要作用的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。但是Apt在發(fā)育過程中的作用機制目前還不明確。Apt在人類中的同源基因FSBP是在人的心臟、腦、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰臟等很多組織表達的癌癥相關(guān)因子,但是其作用機制也不明確。Cyclin E是細(xì)胞進入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子。此外,Cyclin E因為參與細(xì)胞周期的調(diào)控,對于cyclin E的調(diào)控如果出現(xiàn)異常,就會引起癌癥的發(fā)生。但是由于cyclin E啟動子包含一個龐大的、復(fù)雜的順式調(diào)控區(qū)域,這些區(qū)域包含組織和時期特異性組分。因此對cyclin E的調(diào)控存在時空特異性和組織特異性,很多調(diào)控cyclin E的因子有待于進一步鑒定。Hh信號作為對動物發(fā)育十分關(guān)鍵并且進化保守的五大信號通路之一,對生物體的發(fā)育十分關(guān)鍵。但是目前的研究過多的專注于Hh信號通路下游基因的研究,關(guān)于hh自身的調(diào)控目前還不明確。本研究以果蠅為研究材料,發(fā)現(xiàn)Apt從果蠅到人進化保守且C-末端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合DNA的能力,而且在發(fā)育過程中調(diào)控兩個進化保守癌癥相關(guān)基因cyclin E和hh的表達。此外,Apt和Ubx一起控制唾液腺endocycle。通過對轉(zhuǎn)錄因子Apt的研究,能夠為明確Apt人的同源基因FSBP發(fā)育過程中的作用機制提供理論依據(jù),為認(rèn)識endocycle提供新的思路。本研究的主要實驗結(jié)果如下:(1)Apt在發(fā)育過程中通過調(diào)控cyclin E的表達控制細(xì)胞由G1期進入S期。在果蠅眼睛發(fā)育過程中,apt突變體克隆的部位光感受細(xì)胞受到了影響,最終導(dǎo)致成蟲眼睛排列紊亂。超表達apt造成果蠅眼睛缺失。通過進化分析我們發(fā)現(xiàn)Apt從果蠅到人進化保守,并且通過電泳凝膠遷移實驗證明了Apt具有結(jié)合DNA的能力。接下來通過Micorray分析和定量PCR,確定了Apt的靶基因cyclin E。研究發(fā)現(xiàn)在野生型果蠅眼原基,Apt和Cyclin E共表達,在apt突變體克隆的部位,cyclin E表達明顯降低,超表達Apt能夠誘導(dǎo)cyclin E的表達。此外,我們分析cyclin E啟動子元件發(fā)現(xiàn)cyclin E含有Apt的結(jié)合位點。通過報告基因的表達最終確定Apt通過直接結(jié)合到cyclin E的啟動子區(qū)域,調(diào)控cyclin E的轉(zhuǎn)錄,控制細(xì)胞進入S期。(2)Apt在果蠅翅膀發(fā)育過程中通過協(xié)調(diào)hh和cyclin E的表達控制細(xì)胞增殖和生長。實驗過程中發(fā)現(xiàn)apt突變體克隆的果蠅翅膀上出現(xiàn)了水泡狀腫瘤類似表型,并且產(chǎn)生克隆的翅膀會變小。在翅膀上超表達apt后引起翅膀嚴(yán)重變小,翅的模式完全被打亂,也出現(xiàn)了水泡狀表型。異位表達apt后,導(dǎo)致翅膀的缺失。Hh在翅膀發(fā)育過程中作為“組織者”,通過激活和調(diào)控下游一系列基因時空特異性表達,控制翅的發(fā)育。通過apt和hh之間遺傳學(xué)相互作用發(fā)現(xiàn)apt和hh之間存在調(diào)控關(guān)系。免疫熒光染色結(jié)果顯示Apt和Hh在果蠅翅原基共定位。hh報告基因和Hh蛋白在apt突變體克隆里表達減少,超表達Apt能夠誘導(dǎo)hh的表達。之后在hh啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Apt的結(jié)合位點,通過CRISPR/Cas9方法把結(jié)合序列進行突變。結(jié)合位點突變之后hh在mRNA和蛋白水平都顯著降低,并且結(jié)合位點突變的果蠅加重hh突變體表型。之前有研究表明Hh信號能夠通過轉(zhuǎn)錄因子Ci調(diào)控cyclin E轉(zhuǎn)錄。通過分析Ci和Cyclin E的表達模式以及改變Hh信號檢測Cyclin E表達情況,發(fā)現(xiàn)cyclin E的表達不受Hh的影響。Apt能夠通過結(jié)合到hh和cyclin E啟動子區(qū)域,直接調(diào)控hh和cyclin E的表達,但是Apt對cyclin E的調(diào)控和Hh信號無關(guān),并且在果蠅翅原基發(fā)育過程中,Hh信號不能調(diào)控cyclin E。(3)Apt和Ubx控制唾液腺細(xì)胞的endocycle一般的細(xì)胞周期分為G1期、S期、G2期和M期。Endocycle是一種變異的細(xì)胞周期,存在于動物和植物中,大約占到生物種類的一半以上。在endocycle細(xì)胞中,細(xì)胞只進行DNA復(fù)制,不進行有絲分裂,即只有G期和S期,沒有M期。當(dāng)細(xì)胞要進入S期的時候,需要cyclin E的活性,但是Cyclin E表達會抑制復(fù)制前復(fù)合體的形成,會阻止細(xì)胞進入下一個S期的進入,所以Cyclin E需要周期性地變化。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)Apt能夠通過調(diào)控cyclin E的表達參與細(xì)胞endocycle。在Apt誘導(dǎo)cyclin E的同時,還會誘導(dǎo)Hox基因Ubx的表達,而Ubx能夠通過去掉Apt的核定位信號肽的方式使Apt蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì),從而降低細(xì)胞內(nèi)cyclin E的含量,保證endocycle的進行。此外,S期的細(xì)胞也能誘導(dǎo)Ubx的表達,從而使Apt蛋白的定位發(fā)生改變。之前的研究表明轉(zhuǎn)錄因子E2f1和泛素連接酶CRL4CDT2控制唾液腺的endocycle。通過分析我們發(fā)現(xiàn),E2f1依賴的endocycle對Apt的表達有微弱的影響,而這種影響還是通過Ubx引起的。因此,我們推測Apt和Ubx控制的endocycle可能在唾液腺發(fā)育過程中占主導(dǎo)地位。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 apontic cyclin E hedgehog Ultrabithorax Endocycle
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q344
【目錄】：

• 符號說明5-11
• 中文摘要11-13
• 英文摘要13-16
• 1 前言16-33
• 1.1 果蠅眼睛的發(fā)育16
• 1.2 果蠅翅的發(fā)育16-18
• 1.3 Endocycle18-19
• 1.4 Cyclin E研究進展19-23
• 1.4.1 關(guān)于cyclin E的調(diào)控概述19
• 1.4.2 Wg信號對cyclin E的調(diào)控19
• 1.4.3 Abd-A對cyclin E的調(diào)控19-20
• 1.4.4 Hh信號和cyclin E的調(diào)控20
• 1.4.5 Hippo信號對cyclin E的調(diào)控20
• 1.4.6 在中心體中Cyclin E可以通過不依賴CDK2的方式控制細(xì)胞進入S期20-21
• 1.4.7 Prospero在膠質(zhì)細(xì)胞對cyclin E的調(diào)控21
• 1.4.8 Cyclin E對E2f的作用21
• 1.4.9 Cyclin E對dacapo的作用21-22
• 1.4.10 Cyclin E對Double-parked的作用22
• 1.4.11 Ago和Minus對Cyclin E的作用22-23
• 1.5 hedgehog在果蠅翅膀發(fā)育過程中的功能23-25
• 1.6 Hox基因Ubx25
• 1.7 Apt的結(jié)構(gòu)及功能25-31
• 1.7.1 Apt的結(jié)構(gòu)26
• 1.7.2 apt的功能26-31
• 1.7.2.1 apt在果蠅頭部發(fā)育過程中的功能26-27
• 1.7.2.2 apt在果蠅氣管發(fā)育過程中的功能27-28
• 1.7.2.3 apt在果蠅心臟發(fā)育過程中的功能28-29
• 1.7.2.4 apt在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)形成過程中的功能29
• 1.7.2.5 apt限制卵室細(xì)胞遷移29-30
• 1.7.2.6 apt在響應(yīng)乙醇刺激過程中的功能30-31
• 1.7.2.7 apt的其它功能31
• 1.8 本研究的目的及其意義31-33
• 2 材料與方法33-45
• 2.1 材料33-35
• 2.1.1 果蠅及生長條件33
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒33
• 2.1.3 酶及各種生化試劑、抗體33-34
• 2.1.4 試驗中所用的引物和寡核苷酸34-35
• 2.2 方法35-45
• 2.2.1 突變體體細(xì)胞克隆的誘導(dǎo)35
• 2.2.1.1 果蠅重組35
• 2.2.1.2 熱激處理產(chǎn)生突變體體細(xì)胞克隆35
• 2.2.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化35-36
• 2.2.3 質(zhì)粒提取(試劑盒法)36
• 2.2.4 瓊脂糖凝膠DNA回收（試劑盒）36-37
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物純化（試劑盒）37
• 2.2.6 利用CRISPR技術(shù)進行結(jié)合位點突變37-39
• 2.2.6.1 gRNA果蠅注射37-38
• 2.2.6.2 果蠅雜交38-39
• 2.2.6.3 粗提果蠅基因組DNA39
• 2.2.6.4 序列分析39
• 2.2.7 免疫組化（本實驗中常規(guī)抗體染色均參照以下步驟進行）39-40
• 2.2.8 Caspase-3 染色40
• 2.2.9 Western Blot40-42
• 2.2.9.1 組織樣品制備40-41
• 2.2.9.2 分離膠制備41
• 2.2.9.3 濃縮膠制備41
• 2.2.9.4 上樣41
• 2.2.9.5 電泳41
• 2.2.9.6 轉(zhuǎn)膜41
• 2.2.9.7 封閉41-42
• 2.2.9.8 一抗42
• 2.2.9.9 洗脫42
• 2.2.9.10 二抗42
• 2.2.9.11 洗脫42
• 2.2.9.12 檢測42
• 2.2.10 RNA的提取（試劑盒法）42-43
• 2.2.11 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA43
• 2.2.12 RT-qPCR體系及反應(yīng)條件43-44
• 2.2.13 UAS/GAL系統(tǒng)超表達和RNA干涉基因44
• 2.2.14 掃描電子顯微鏡觀察44-45
• 3 結(jié)果與分析45-64
• 3.1 Apt在果蠅眼睛發(fā)育過程中通過誘導(dǎo)Cyclin E的表達控制細(xì)胞進入S期45-51
• 3.1.1 Apt是進化保守的DNA結(jié)合蛋白45
• 3.1.2 Apt在果蠅眼原基的表達分析45-46
• 3.1.3 Apt對果蠅眼睛發(fā)育的作用46-47
• 3.1.4 Apt下游靶基因的鑒定47-48
• 3.1.5 Apt在MF對Cyclin E的作用48-49
• 3.1.6 Apt對Cyclin E的調(diào)控方式分析49-51
• 3.2 Apt在果蠅翅膀發(fā)育過程中通過協(xié)調(diào)hedgehog和cyclin E的表達調(diào)控細(xì)胞增殖和生長51-59
• 3.2.1 Apt在果蠅翅原基的表達及功能分析51-52
• 3.2.2 Apt在PE對hh的作用分析52-53
• 3.2.3 Apt在果蠅翅原基對hh的作用方式分析53-55
• 3.2.4 Apt在PE對cyclin E的作用55-56
• 3.2.5 Apt在翅原基對cyclin E的作用方式分析56-57
• 3.2.6 Apt通過誘導(dǎo)hh和cyclin E的表達來控制細(xì)胞增殖57-59
• 3.3 Apt和Ubx控制果蠅唾液腺的endocycle59-64
• 3.3.1 Apt在唾液腺的表達和作用59
• 3.3.2 Apt在唾液腺發(fā)育過程中對cyclin E的作用分析59-61
• 3.3.3 Ubx和Apt對細(xì)胞endocycle的作用方式分析61-62
• 3.3.4 Apt，Ubx和E2f1協(xié)同唾液腺endocycle62-64
• 4 討論64-67
• 4.1 Apt的功能64
• 4.2 Cyclin E的調(diào)控64-65
• 4.3 Hh的表達65-66
• 4.4 Hh的調(diào)控66
• 4.5 Endocycle中Apt，Ubx和Cyclin E之間的關(guān)系66-67
• 5 結(jié)論67-68
• 參考文獻68-84
• 致謝84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況85

【相似文獻】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王賢鋒;Apontic在果蠅器官發(fā)育過程中的功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：Apontic在果蠅器官發(fā)育過程中的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：255756