【摘要】：脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)具有嗜酸耐熱性,是果汁工業(yè)中關(guān)鍵的質(zhì)量安全因子,受到了果汁生產(chǎn)廠家和科研工作者的廣泛關(guān)注。脂環(huán)酸芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物——愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生一種類似于苯酚類化合物的“藥味”和“消毒水味”,含量很低時(shí)即可給果汁帶來(lái)不愉快的氣味。因此,本研究以愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生為主線,篩查了脂環(huán)酸芽孢桿菌產(chǎn)愈創(chuàng)木酚的前體物,解析了脂環(huán)酸芽孢桿菌利用香草酸和香草醛產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的代謝途徑,同時(shí)研究了愈創(chuàng)木酚生成過(guò)程中的關(guān)鍵酶——香草酸脫羧酶的基本性質(zhì)及編碼基因,在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測(cè)和控制方法體系。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌產(chǎn)愈創(chuàng)木酚的前體物進(jìn)行了篩查,通過(guò)生長(zhǎng)細(xì)胞、靜息細(xì)胞及細(xì)胞破碎等手段并結(jié)合HPLC和LC-MS檢測(cè)技術(shù)對(duì)中間代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶進(jìn)行了解析。研究結(jié)果表明:A.acidoterrestris可以利用香草酸和香草醛產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚,但不能代謝兒茶酚、阿魏酸、酪氨酸和苯丙氨酸生成。在NAD(P)+依賴的香草醛脫氫酶的作用下,A.acidoterrestris(DSM 3923)先將香草醛氧化成香草酸,再通過(guò)香草酸脫羧酶的非氧化脫羧反應(yīng)生成愈創(chuàng)木酚,同時(shí)還有小部分的香草醛被NADPH依賴的香草醛還原酶轉(zhuǎn)化為香草醇。A.acidoterrestris(DSM 3923)中的香草酸脫羧酶是非氧氣敏感性的,催化反應(yīng)不需要輔助因子吡啶核苷酸,并且是可逆的,但脫羧效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于羧化效率,ATP的添加對(duì)羧化作用無(wú)顯著影響。(2)研究了A.acidoterrestris(DSM 3923)生長(zhǎng)過(guò)程中香草酸脫羧酶的活性變化,對(duì)比分析了超聲波、溶菌酶、細(xì)胞裂解液和甲苯滲透法對(duì)A.acidoterrestris(DSM 3923)細(xì)胞中香草酸脫羧酶的提取效果,優(yōu)化建立了最佳的提取方法,并評(píng)價(jià)了不同因素對(duì)酶活性的影響。結(jié)果表明:香草酸脫羧酶在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的比活力最大(3.23 U/mg),隨著生長(zhǎng)的進(jìn)行比活力迅速下降。在超聲功率330 W、破碎總時(shí)間12 min、超聲間歇時(shí)間1 s/5 s、菌體質(zhì)量濃度0.38 mg/mL條件下,提取獲得的香草酸脫羧酶活力最高(7.68U/mg)。同時(shí),香草酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度為45℃,最適反應(yīng)pH值為6.0-6.5;Co2+和Mn2+對(duì)香草酸脫羧酶的活性有一定的促進(jìn)作用,Na+、K+、Li+、Mg2+和Fe2+對(duì)其活性無(wú)顯著影響,而Ni2+、Cu2+、Ba2+、Fe2+有強(qiáng)烈的抑制作用;當(dāng)添加濃度為1 mmol/L時(shí),肉桂酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素和蘆丁可以完全抑制酶的活性。(3)對(duì)A.acidoterrestris(DSM 3923)中香草酸脫羧酶的編碼基因(vdc)進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):A.acidoterrestris中vdc基因全長(zhǎng)3309 bp,包含vdcA、vdcB、vdcC和vdcD四個(gè)基因。vdcA的全長(zhǎng)為894 bp,其蛋白為L(zhǎng)ysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子;vdcB、vdcC和vdcD的長(zhǎng)度分別為597、1425和231 bp,推測(cè)編碼的蛋白質(zhì)分別為酚酸脫羧酶B、C和D亞基�？疾炝酥h(huán)酸芽孢桿菌愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生能力與vdcC基因的相關(guān)性,結(jié)果在愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌中均擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)了vdcC基因,而非產(chǎn)生菌中均未擴(kuò)增到。對(duì)vdcC基因進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)A.acidoterrestris、A.herbarius和A.acidiphilus種間部分vdcC基因序列的相似性為87.3%,而A.acidoterrestris和A.herbarius種內(nèi)的相似性分別為99.5%和99.1%,說(shuō)明vdcC基因在同一種內(nèi)具有很高的保守性,為以vdcC基因序列為基礎(chǔ)在種的水平上進(jìn)行脂環(huán)酸芽孢桿菌愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的檢測(cè)提供了依據(jù)。(4)采用Clustal X軟件分析了不同物種vdcC基因的同源性,并用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)獲得了特異性引物,建立了蘋果汁中A.acidoterrestris的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,研究結(jié)果表明:基于vdcC基因的Real-time PCR體系對(duì)A.acidoterrestris有較好的特異性,檢測(cè)靈敏度為2.6×101 CFU/mL;對(duì)蘋果汁加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),其擴(kuò)增效率為105.86%,標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.987。同時(shí),構(gòu)建了蘋果汁樣品中A.acidoterrestris含量與其代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,所得擬合曲線的相關(guān)性良好,R2=0.833,為蘋果汁中A.acidoterrestris和愈創(chuàng)木酚的同時(shí)快速檢測(cè)提高了思路和方法。(5)考察了二氧化氯單獨(dú)處理或與超聲波及振蕩聯(lián)合處理對(duì)蘋果表面A.acidoterrestris芽孢的去除作用,結(jié)果表明:二氧化氯耦合振蕩法的去除效果最好,當(dāng)二氧化氯添加濃度為200 mg/L、振蕩頻率為200 rpm時(shí),處理20 min,可以全部殺滅蘋果表面的芽孢。同時(shí)探究了pH值對(duì)芽孢去除效果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):酸性條件有利于二氧化氯對(duì)A.acidoterrestris芽孢的殺滅,而堿性條件更利于芽孢與蘋果表面的分離。在振蕩條件下(200 rpm),以質(zhì)量濃度為50 mg/L的二氧化氯(pH=2.5)對(duì)人工污染有3、4和5 log10 CFU/蘋果的樣品分別處理5、10和20 min,可以將蘋果表面的A.acidoterrestris芽孢全部去除,為A.acidoterrestris的源頭控制提供了技術(shù)參數(shù)。(6)探究了果汁中常用防腐劑對(duì)A.acidoterrestris生長(zhǎng)及愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明:脫氫乙酸、ε-聚賴氨酸和肉桂酸可以有效控制A.acidoterrestris的生長(zhǎng)及愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生。在蘋果汁中分別添加270 mg/L脫氫乙酸、108 mg/L肉桂酸或100 mg/Lε-聚賴氨酸,培養(yǎng)2周后,A.acidoterrestris的菌落數(shù)分別降低了3.43、3.17和4.78 log10CFU/mL,并且在果汁樣品中未檢測(cè)到愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生。感官評(píng)價(jià)的結(jié)果顯示這些物質(zhì)的添加對(duì)蘋果汁的感官品質(zhì)和可接受性無(wú)顯著性影響,為果汁終產(chǎn)品中脂環(huán)酸芽孢桿菌的有效控制提供了依據(jù)和方法。
【圖文】：

圖 1-1 脂環(huán)酸芽孢桿菌屬不同菌株 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（Nakano et al. 2015）Figure 1-1 Phylogenetic distance tree derived from comparison of the 16S rRNA gene sequences ofdifferent Alicyclobacillus species.1.2 主要特征脂環(huán)酸芽孢桿菌的特性主要包括三方面：基本的細(xì)胞形態(tài)特征、細(xì)胞膜的主要脂

孢桿菌的代謝產(chǎn)物主要包括愈創(chuàng)木酚和鹵酚兩類惡臭物質(zhì)，溴苯酚和 2,6-二氯苯酚，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖 1-2 所示，，愈創(chuàng)木酚是最主要也是關(guān)注最多的污染物；同時(shí)，在一些污二溴苯酚、2,4-二氯苯酚和 2,4,6-三氯苯酚等化學(xué)物質(zhì)（ChSmit et al. 2011；Steyn et al. 2011）。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS201.3


本文編號(hào)：2541496