【摘要】：食品、醫(yī)療領(lǐng)域中的設(shè)備、器械、材料等固體表面在使用過程中易被細菌粘附而形成菌膜。被菌膜污染的表面會造成與之接觸的食品腐壞、生物組織感染,嚴重威脅消費者與患者的健康。菌膜成熟后難以被清除,因此,為了減少菌膜的污染,就需對菌膜成熟之前的階段(即細菌在表面上的粘附與生長階段)進行深入研究。目前,針對控制細菌粘附的方法多為在表面上鍵合消毒劑基團、抗生素分子等化學方法。然而上述方法具有風險,如:消毒劑具有很強的細胞毒性、抗生素促使細菌產(chǎn)生耐藥性等,使得化學方法抑制細菌粘附在食品、醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了極大的限制。因此,在表面上構(gòu)建三維規(guī)則微觀形貌的物理方法成為了當前的研究熱點。但是,細菌在規(guī)則形貌上的粘附方式尚不清楚;針對細菌粘附后的增殖生長過程研究也較為匱乏,相關(guān)的生長動力學、菌體的細胞行為等尚無明確報道。本文選取食品、醫(yī)療工業(yè)中常用的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)材料作為研究基底,以大腸桿菌作為受試菌株,首先建立合適的表面形貌物理改造方法,在PET基底上構(gòu)建具有多圖案元素、尺寸梯度的三維規(guī)則結(jié)構(gòu),并系統(tǒng)研究不同培養(yǎng)條件下三維形貌對細菌粘附的影響,明確細菌對規(guī)則結(jié)構(gòu)的粘附響應(yīng)方式;針對菌體的生長階段,從生物物理角度詳盡考察粘附后的菌體在PET平坦表面上的生長動力學、分裂與細胞尺寸控制機理、各生長時期菌體的表現(xiàn)行為以及菌體與基底表面之間的相互作用,并明確菌毛對菌體粘附及生長過程的作用。論文的主要研究內(nèi)容包括:(1)PET表面規(guī)則微觀形貌的構(gòu)建及其對大腸桿菌粘附過程的影響采用紫外線光刻技術(shù)+熱壓印法:將AutoCAD軟件中設(shè)計的二維圖案通過紫外線光刻技術(shù)轉(zhuǎn)移到硅片主模上形成三維規(guī)則結(jié)構(gòu),再分別通過聚二甲硅氧烷(PDMS)軟印章、環(huán)氧樹脂進行兩次三維結(jié)構(gòu)傳遞以制作熱壓硬模具,最后應(yīng)用熱壓印法在PET表面上構(gòu)建出三維規(guī)則微觀形貌。采用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)對傳遞后的微觀形貌進行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn):PET表面上形成了良好的微米級(1-8?m)三維結(jié)構(gòu)。采用紅外光譜(IR)、接觸角測定儀測定熱壓處理前后PET表面分子結(jié)構(gòu)、疏水性質(zhì)的變化,結(jié)果顯示PET表面的分子結(jié)構(gòu)、疏水性質(zhì)在熱壓前后沒有發(fā)生顯著變化。采用上述方法,在PET表面上構(gòu)建出同時包含彎曲邊緣、直邊緣、凸出柱體平面以及柱體之間的凹谷平面的三維規(guī)則形貌,并有六個尺寸梯度。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)、SEM手段分別考察寡/富營養(yǎng)、靜/動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下,大腸桿菌在規(guī)則微觀形貌上的粘附數(shù)量、在各圖案元素上的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):菌體可以感知PET表面的微觀形貌:對三維結(jié)構(gòu)曲率小的邊緣地帶表現(xiàn)出明顯的偏好性粘附;曲率大的區(qū)域在初期可以抑制大腸桿菌的粘附,但長期培養(yǎng)后,菌體可以克服不利的物理地形;細菌對各圖案元素粘附時表現(xiàn)出的偏好性越小,菌體在該三維規(guī)則微觀形貌的粘附數(shù)量越少。并且,菌體對微觀形貌的感知能力與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān),環(huán)境中營養(yǎng)較少并存在流體剪切應(yīng)力時,菌體會失去對微觀形貌的感知能力。(2)大腸桿菌在PET表面的生長與細胞尺寸控制方式采用CLSM測定粘附后的大腸桿菌在PET表面上分裂增殖形成微菌落的過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn):附著在表面上的菌體的生長動力學曲線表現(xiàn)出與傳統(tǒng)生長曲線相似的“延滯期”、“對數(shù)期”。子代細胞的倍增時間為38 min,而相同培養(yǎng)條件下,游離在培養(yǎng)液中的大腸桿菌的倍增時間為16 min。同時,首次發(fā)現(xiàn)并證實大腸桿菌在表面上的生長過程中,微菌落形態(tài)、細胞尺寸均由群體效應(yīng)方式控制。(3)I型菌毛對大腸桿菌在PET表面上粘附和生長的影響構(gòu)建無I型菌毛的大腸桿菌突變菌,采用CLSM考察I型菌毛對大腸桿菌可逆性粘附、不可逆性粘附以及增殖生長過程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):I型菌毛對可逆性粘附過程影響不顯著,對不可逆吸附階段影響顯著。無菌毛的突變菌無法進入不可逆吸附階段,也無法在PET表面上進行增殖生長。(4)粘附和生長過程中表面大腸桿菌對剪切應(yīng)力的響應(yīng)將往復(fù)振動裝置產(chǎn)生的流體剪切應(yīng)力,作用于在PET表面上處于粘附或增殖生長過程的大腸桿菌。采用CLSM考察處理后菌體在表面上的存留數(shù)量以及死活狀態(tài),進而了解粘附、生長過程中菌體與基底表面的相互作用力的變化,并探究群體效應(yīng)對表面上生長的野生型大腸桿菌對剪切應(yīng)力的響應(yīng)變化。結(jié)果顯示:存留比例以及菌體對表面粘附力的大小排序均為“延滯期”“單層微菌落”時期“多層微菌落”時期,存留比例只與菌體所處生長狀態(tài)有關(guān),與培養(yǎng)時間、菌落大小無關(guān);菌體活細胞比例與微菌落大小有關(guān),而與菌體所處生長狀態(tài)無關(guān);群體效應(yīng)得到抑制后,微菌落中細菌抵抗外界流體剪切應(yīng)力的能力降低。
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第二章 PET 表面規(guī)則微觀形貌的構(gòu)建及其對大腸桿菌粘附過程的影響在富營養(yǎng)環(huán)境中，活、死菌體在動態(tài)培養(yǎng)條件下的粘附數(shù)量均多于靜態(tài)培養(yǎng)條件下的粘附數(shù)量（圖 2-8（a））。靜態(tài)培養(yǎng)時，在 PET 基底上觀察不到死亡菌體的粘附，只有活細胞可以粘附在表面上；而死亡菌體在動態(tài)培養(yǎng)條件下時，即菌體懸浮液對表面有較小的剪切應(yīng)力作用時，卻可以粘附到表面上。如圖 2-8（a）所示，死細胞粘附數(shù)量最少的是平坦對照表面，圖 2-8（b）顯示出，活、死菌體比例相差最大的也是平坦對照表面，這說明在動態(tài)培養(yǎng)條件下，三維結(jié)構(gòu)的存在更有助于死亡菌體的粘附。值得注意的是，從圖 2-8（a）中觀察到，無論是靜態(tài)還是動態(tài)培養(yǎng)，活菌的數(shù)量隨圖案編號 1-6 的變化趨勢相同。

圖 5-1 往復(fù)直線振動裝置Fig. 5-1 The device of reciprocating linear vibration 掃描圖像處理及數(shù)據(jù)分析AS AF lite 軟件輸出兩個光電倍增管頻道得到的掃描圖片，然后NIH, Bethesda, Maryland, http://rsbweb.nih.gov/ij/）處理圖像，并據(jù)點平行重復(fù)實驗三次（包括生長培養(yǎng)、剪切應(yīng)力的作用），單A）由 Microsoft Excel 計算，文中數(shù)據(jù)為平均值±標準方差。與討論實際中，表面清洗劑清洗設(shè)備、管路時，表面細菌有時不能很要流體剪切力的輔助[172]。菌體去除的動力學與液體清潔劑的流數(shù)有關(guān)[173, 174]。在現(xiàn)有關(guān)于剪切應(yīng)力對菌體的影響相關(guān)文獻報道行板流動室（parallel plate flow chamber），，此裝置可隨實驗需要用顯微鏡可在線觀察細胞粘附、脫離或菌膜生長狀況[164, 170, 175]。材料表面菌體的影響均是在單一方向流速條件下進行，針對多方
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q93

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1 郭U

本文編號：2540676