【摘要】：κ型阿片受體(κ-opioid receptor,KOR)和緩激肽2型受體(bradykinin B2 receptor,B2R)都屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,二者及其配體強(qiáng)啡肽(dynorphin,DYN)和緩激肽(bradykinin,BK)廣泛分布于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前,有關(guān)KOR和B2R兩種受體相互作用的研究未見報(bào)道。本課題運(yùn)用生物物理方法研究二者間的異源二聚化作用,以及形成異源二聚體后對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響,探討KOR/B2R異源二聚體在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在神經(jīng)保護(hù)作用中的分子機(jī)制,為神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和藥物研發(fā)提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題利用pcDNA3.1-KOR和pcDNA3.1-B2R質(zhì)粒建立了穩(wěn)定表達(dá)KOR、B2R或KOR/B2R的HEK293細(xì)胞。pcDNA3.1-KOR和EGFP-B2R共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光染色,共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示KOR與B2R在細(xì)胞中的分布高度一致,且主要定位于細(xì)胞膜。RT-PCR結(jié)果顯示KOR和B2R均內(nèi)源性表達(dá)于SH-SY5Y細(xì)胞,這些結(jié)果為下一步進(jìn)行二聚體的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建了KOR-Rluc和B2R-mVenus兩種重組質(zhì)粒,共同或單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。生物發(fā)光檢測(cè)和熒光檢測(cè)確保各組受體表達(dá)水平一致,BRET檢測(cè)結(jié)果顯示,KOR-Rluc與B2R-mVenus共轉(zhuǎn)染組的BRET值與其它陰性對(duì)照組相比差異顯著,表明KOR和B2R之間能夠發(fā)生相互作用。在飽和實(shí)驗(yàn)中,固定供體KOR-Rluc的量不變,受體B2R-m Venus的量逐漸增加,結(jié)果顯示,KOR-Rluc和B2R-mVenus共轉(zhuǎn)染組的BRET值呈現(xiàn)雙曲線形式增加,最終達(dá)到平臺(tái)期,對(duì)照組pcDNA3.1-Rluc和B2R-mVenus共轉(zhuǎn)染組以及mVenus和KOR-Rluc共轉(zhuǎn)染組BRET值沒(méi)有明顯增加,是一種非特異性的線性關(guān)系。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示,隨著未標(biāo)記受體轉(zhuǎn)染量的增加,兩受體間的BRET值逐漸降低。BRET飽和實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,KOR和B2R間的相互作用是特異的,而不是由受體過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的分子間的隨機(jī)碰撞引起的,排除了受體過(guò)表達(dá)引起的假陽(yáng)性。FRET技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞中KOR和B2R間的相互作用。在共轉(zhuǎn)染KOR-CFP和B2R-mVenus的細(xì)胞中,FRET信號(hào)明顯強(qiáng)于受體單轉(zhuǎn)組和陰性對(duì)照組。KOR-CFP和B2R-mVenus間的FRET現(xiàn)象可發(fā)生在CHO等不同類型的細(xì)胞中,表明二者的相互作用不受細(xì)胞類型的限制,沒(méi)有細(xì)胞類型的偏向性。鄰位連接分析技術(shù)(proximity ligation assay,PLA)更直觀地證實(shí),KOR和B2R可發(fā)生相互作用形成異源二聚體。本課題對(duì)camp、camp應(yīng)答元件(campresponseelement,cre)、血清反應(yīng)元件(serumresponseelement,sre)和camp應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(camp-responseelement-bindingprotein,creb)等信號(hào)分子進(jìn)行了檢測(cè)。與hek293-kor和hek293-b2r細(xì)胞相比,dyna(1-13)顯著提高了hek293-kor/b2r細(xì)胞中camp的表達(dá)水平,而bk不能通過(guò)kor/b2r二聚體影響camp的表達(dá)。camp作為細(xì)胞內(nèi)第二信使,通常是gαs蛋白下游信號(hào)中間分子,受gαs活化程度的影響。為研究二聚體和g蛋白間的偶聯(lián)關(guān)系,實(shí)驗(yàn)采用gαs-rluc8、gαi2-rluc8或gαq-rluc8與kor-mvenus、b2r-mvenus或kor-mvenus和b2r共同轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞,同時(shí)轉(zhuǎn)染未標(biāo)記的gβ1和gγ2蛋白亞基,進(jìn)行bret分析。在dyna(1-13)刺激后,與單獨(dú)表達(dá)kor或b2r的細(xì)胞相比,kor-mvenus和rluc8-gαs共轉(zhuǎn)染組的bret信號(hào)顯著增強(qiáng),提示激動(dòng)劑刺激后kor/b2r二聚體傾向于結(jié)合并激活gαs蛋白亞基。為檢測(cè)kor和b2r二聚體對(duì)下游信號(hào)的影響,本研究運(yùn)用雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了細(xì)胞中cre和sre的活性。共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中cre-luc的活性要顯著高于kor或b2r單轉(zhuǎn)染組,sre的活性顯著低于kor單轉(zhuǎn)染組,和對(duì)照組hek293細(xì)胞相比沒(méi)有明顯變化。實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)激動(dòng)劑dyna(1-13)刺激hek293-kor/b2r細(xì)胞時(shí),kor和b2r間的異源二聚化作用增強(qiáng)了cre的活性,而cre的活性依賴于pka的激活。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了,kor/b2r異源二聚體能夠和gαs結(jié)合進(jìn)而增強(qiáng)cre的活性。通常,gpcr與gαs結(jié)合可激活腺苷酸環(huán)化酶,進(jìn)而增強(qiáng)creb的磷酸化水平。為確定kor/b2r二聚體能否影響creb的磷酸化,在用激動(dòng)劑dyna(1-13)處理后,westernblot對(duì)creb的活化水平進(jìn)行了濃度依賴和時(shí)間依賴性檢測(cè)。用濃度為10-7m的dyna(1-13)處理各組細(xì)胞0-60分鐘,5分鐘時(shí),hek293-kor/b2r細(xì)胞中creb的活化水平有明顯的增強(qiáng),并隨時(shí)間逐漸降低。在濃度依賴性實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)dyna(1-13)的濃度增強(qiáng)時(shí),hek293-kor/b2r細(xì)胞中creb的磷酸化水平隨著激動(dòng)劑dyna(1-13)濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。在sh-sy5y細(xì)胞中,creb的磷酸化水平同樣表現(xiàn)出濃度依賴性增強(qiáng)。分別用pka抑制劑h89和plc抑制劑u73122對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,只有hek293-kor/b2r細(xì)胞中磷酸化creb的表達(dá)要水平明顯受到h89的抑制,而其它單轉(zhuǎn)組未受到明顯的影響。u73122未對(duì)共轉(zhuǎn)染組creb的活性產(chǎn)生較為明顯的影響。這充分說(shuō)明,hek293-kor/b2r細(xì)胞中kor/b2r二聚體對(duì)creb的激活是通過(guò)gαs/camp/pka信號(hào)途徑介導(dǎo)的,而非plc/pkc信號(hào)途徑。為更有力地證實(shí)kor/b2r二聚體對(duì)creb磷酸化的影響,我們用shrna-kor或shRNA-B2R對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中KOR和B2R受體進(jìn)行干擾。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,KOR-shRNA和B2R-shRNA顯著降低了SH-SY5Y細(xì)胞中KOR和B2R的表達(dá),同時(shí)Dyn A(1-13)誘導(dǎo)的CREB的磷酸化水平明顯降低。有趣的是,B2R的沉默同樣降低了Dyn A(1-13)誘導(dǎo)的CREB磷酸化水平,這說(shuō)明在SH-SY5Y細(xì)胞中,KOR和B2R是作為一個(gè)復(fù)合物發(fā)揮作用,在Dyn A(1-13)的刺激下可增強(qiáng)CREB磷酸化的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多種方法證實(shí),KOR和B2R能夠在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用形成異源二聚體,并顯著影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。為檢測(cè)二聚體特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)細(xì)胞功能的影響,我們利用CCK-8細(xì)胞活性分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞增殖活性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,Dyn A(1-13)能顯著增強(qiáng)HEK293-KOR/B2R細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng),而HEK293-KOR和HEK293-B2R細(xì)胞的活性沒(méi)有發(fā)生改變。如前所述,Dyn A(1-13)能顯著增強(qiáng)人SH-SY5Y細(xì)胞中CREB的磷酸化,與此相對(duì)應(yīng),Dyn A(1-13)同樣能顯著促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。本課題首次證明了KOR和B2R兩種GPCR能組成性的相互作用形成異源二聚體,并能誘導(dǎo)產(chǎn)生新的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KOR/B2R異源二聚體介導(dǎo)的Gαs/cAMP/PKA信號(hào)通路的活化增強(qiáng)了CREB的磷酸化水平,促進(jìn)了SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。本研究初步闡明了KOR/B2R異源二聚體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在神經(jīng)保護(hù)過(guò)程中的分子機(jī)制,為神經(jīng)損傷等神經(jīng)疾病的治療和相關(guān)藥物的設(shè)計(jì)提供了有價(jià)值的參考依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q257

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本文編號(hào)：2457918