【摘要】：在模式植物擬南芥中紫外光UV-B光受體UVR8蛋白感受并起始UV-B誘導(dǎo)的植物光形態(tài)建成,不同于傳統(tǒng)的光受體,UVR8蛋白以自身的色氨酸作為生色團(tuán)來(lái)感知UV-B從而起始下游信號(hào)通路。植物接收到UV-B后,UVR8構(gòu)象發(fā)生變化,由精氨酸維系的同源二聚體的形式變成了單體的形式,單體狀態(tài)的UVR8與從CUL4-DDB1 E3連接酶上解離下來(lái)的COP1-SPA形成新的復(fù)合體,此UV-B依賴(lài)的UVR8-COP1-SPA復(fù)合體的形成使得COP1的作用發(fā)生改變:從可見(jiàn)光光形態(tài)建成中負(fù)調(diào)控因子的作用變?yōu)閁V-B信號(hào)中正調(diào)控因子的作用。但是UVR8蛋白中重要的氨基酸殘基,如負(fù)責(zé)光吸收和二聚體維系的氨基酸,對(duì)于UVR8在UV-B信號(hào)中的生物學(xué)意義并不是很清楚。前面關(guān)于UVR8蛋白的研究和報(bào)道基本是通過(guò)酵母系統(tǒng)以及結(jié)構(gòu)解析等非植物體內(nèi)體系實(shí)現(xiàn)的,UVR8在植物體內(nèi)是如何行使功能的并不清楚。本論文主要研究UVR8蛋白中重要的氨基酸殘基對(duì)其在UV-B誘導(dǎo)的植物光形態(tài)建成中功能和活性的影響,獲得如下結(jié)果:1)通過(guò)定點(diǎn)突變獲得了UVR8蛋白的光吸收氨基酸突變W233A、W233F、W285A、W285F和二聚體維系氨基酸突變R286A和R338A。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥侵染的方法將UVR8野生型及突變體引入擬南芥基因組并獲得單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因材料,挑選出蛋白表達(dá)水平相一致的株系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2)在酵母系統(tǒng)中檢測(cè)了在應(yīng)答光形態(tài)建成的UV-B時(shí),UVR8的構(gòu)象變化和與cop1的相互作用。與以前的研究結(jié)果相一致,uvr8wt能應(yīng)答uv-b發(fā)生二聚體變單體的構(gòu)象變化,以及uv-b誘導(dǎo)的與cop1的相互作用,而組成型二聚體形式的uvr8w285f與cop1之間不存在相互作用,其余點(diǎn)突變?yōu)榻M成型單體形式和組成型的與cop1的相互作用。3)uvr8點(diǎn)突變會(huì)造成植物uv-b生理應(yīng)答不同程度的改變,通過(guò)對(duì)uv-b誘導(dǎo)的下胚軸縮短和花青素積累這兩個(gè)生理學(xué)特征的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),uvr8wt能將突變體uvr8-6恢復(fù)到野生型水平,在所有點(diǎn)突變的材料中uvr8r338的恢復(fù)程度最為明顯,但弱于uvr8wt,而uvr8w285a和uvr8r286a表型基本與突變體uvr8-6表型一致,其余點(diǎn)突變表現(xiàn)出的情況介于兩者中間。4)uvr8點(diǎn)突變影響了uv-b響應(yīng)基因的表達(dá),通過(guò)熒光定量pcr檢測(cè)了uv-b應(yīng)答基因elip2、ugt48a1和chs在不同uvr8點(diǎn)突變材料中受uv-b誘導(dǎo)的情況。在uvr8wt中能檢測(cè)到這些基因明顯被uv-b誘導(dǎo)表達(dá),在uvr8r338a中誘導(dǎo)同樣明顯。但在其余的uvr8點(diǎn)突變中uv-b誘導(dǎo)的基因表達(dá)都不同程度下調(diào)。檢測(cè)cop1和hy5的mrna發(fā)現(xiàn),uvr8點(diǎn)突變對(duì)cop1受uv-b誘導(dǎo)的影響與下游應(yīng)答基因受影響情況類(lèi)似,而hy5mrna在uvr8w233f和uvr8r338a中都存在誘導(dǎo)。cop1和hy5蛋白受uv-b誘導(dǎo)積累的表型在uvr8w285f和uvr8r286a中幾乎檢測(cè)不到。同時(shí)發(fā)現(xiàn)除uvr8r338a,uv-b誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子rup1和rup2的積累在uvr8點(diǎn)突變中誘導(dǎo)程度都被減弱。5)uvr8點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致uv-b誘導(dǎo)的光感受、uvr8單體化以及與cop1的相互作用受到影響。通過(guò)測(cè)量植物蛋白在310nm處的光吸收值,我們發(fā)現(xiàn)色氨酸w233和w285的突變會(huì)導(dǎo)致吸光能力的完全喪失,二聚體維系氨基酸r286和r338a的突變會(huì)導(dǎo)致吸光能力減弱。uvr8二聚體單體分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)uvr8點(diǎn)突變對(duì)uvr8構(gòu)象的影響與酵母中一樣,但與cop1的相互作用與酵母中存在矛盾,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)uvr8w285f和uvr8r286a完全不與cop1相互作用,uvr8w233a和uvr8w233f可以組成型的共沉淀下來(lái)少量的cop1,在沒(méi)有uv-b的條件下uvr8w285a和uvr8r338a可以共沉淀下來(lái)中等強(qiáng)度的cop1,兩者的區(qū)別在于在uv-b處理的條件下uvr8r338a可以共沉淀下來(lái)更多的cop1。6)鑒定到了兩個(gè)組成型光形態(tài)建成的材料uvr8w285a和uvr8r338a,并且發(fā)現(xiàn)uvr8表現(xiàn)出的組成型活性依賴(lài)于持續(xù)的uvr8與cop1的相互作用。在沒(méi)有uv-b的條件下,uvr8w285a和uvr8r338a下胚軸長(zhǎng)度都比uvr8wt短、花青素含量和標(biāo)志基因的水平都比uvr8wt高,uv-b處理之后,uvr8w285a對(duì)uv-b基本不應(yīng)答,而uvr8r338a還能受uv-b的誘導(dǎo),這與突變體蛋白和cop1之間的相互作用強(qiáng)度緊密相關(guān)。在暗中uvr8w285a和uvr8r338a出現(xiàn)子葉打開(kāi)的組成型光形態(tài)建成的表型。并且它們的光生物學(xué)活性會(huì)因uv-b信號(hào)通路中負(fù)調(diào)控因子cul4的抑制而增強(qiáng)。綜上所述,本論文闡述了uvr8蛋白中重要氨基酸殘基對(duì)于uvr8正常功能的重要性,并提出uv-b依賴(lài)uvr8-cop1的相互作用調(diào)控植物UV-B信號(hào)的輸出和傳遞的分子機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

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1 童哲;連漢平;段靜霞;崔o，

本文編號(hào)：2451224