【摘要】：生物體中的多不飽和脂肪酸是通過脂肪酸合成途徑逐步生成的,而Δ6脂肪酸脫飽和酶(delta 6 fatty acid desaturase,FADS6)是這個途徑中催化亞油酸(linoleic acid,LA)和α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA)在6位碳脫飽和分別形成γ-亞麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和十八碳四烯酸(stearidonic acid,SDA)的關(guān)鍵酶,該酶的底物選擇性直接決定生物體內(nèi)ω6和ω3脂肪酸的分布。在ω6和ω3組成比例存在顯著差異的生物體中,其Δ6脂肪酸脫飽和酶的底物選擇性不同。高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)已被廣泛應(yīng)用于花生四稀酸(arachidonic acid,AA)的生產(chǎn),其ω6系脂肪酸含量達到總脂含量的40%,而ω3系脂肪酸如二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)含量很低(僅低溫能產(chǎn),含量為1-3%);而細小微胞藻中EPA含量達到總脂含量的26%,ω6系脂肪酸含量卻很低(僅0.1%左右)。本研究從分析高山被孢霉和細小微胞藻的Δ6脂肪酸脫飽和酶基因入手,從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)層面解析影響FADS6底物選擇性的關(guān)鍵區(qū)域和位點,并將偏好ω3系的細小微胞藻Δ6脂肪酸脫飽和酶基因應(yīng)用于高山被孢霉生物合成EPA的研究。主要研究結(jié)果如下:1.Δ6脂肪酸脫飽和酶的底物選擇性研究:以pYES2/NT C質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了細小微胞藻Δ6脂肪酸脫飽和酶基因和高山被孢霉Δ6-I與Δ6-II脂肪酸脫飽和酶基因的表達載體并轉(zhuǎn)化至釀酒酵母,通過在培養(yǎng)基中添加Δ6脂肪酸脫飽和酶的底物來考察3個Δ6脂肪酸脫飽和酶對各底物的選擇性。結(jié)果表明,高山被孢霉中Δ6-I脂肪酸脫飽和酶(MaFADS6-I)對ω6系的LA具有底物選擇性,Δ6-II脂肪酸脫飽和酶(MaFADS6-II)對底物沒有選擇性,而細小微胞藻中Δ6脂肪酸脫飽和酶(MpFADS6)對ω3系的ALA具有底物選擇性。2.分析影響Δ6脂肪酸脫飽和酶底物選擇性的結(jié)構(gòu)區(qū)域:為研究MaFADS6-I和MpFADS6具有不同底物偏好作用的機制,將兩者的氨基酸序列按照保守區(qū)域劃分為五部分,利用重疊延伸PCR的方法獲得了十種重組Δ6脂肪酸脫飽和酶的融合基因,并在釀酒酵母中測定了這十種Δ6脂肪酸脫飽和酶融合酶的活性。結(jié)果表明,Δ6脂肪酸脫飽和酶中His I區(qū)和His II區(qū)之間的片段對其底物選擇性有重要影響;細胞色素b5區(qū)(HPGG)和His I區(qū)之間的片段也對其底物選擇性有影響;底物濃度的改變不會影響Δ6脂肪酸脫飽和酶的底物選擇性。3.分析影響Δ6脂肪酸脫飽和酶活性的關(guān)鍵催化位點:在定位了影響Δ6脂肪酸脫飽和酶底物選擇性關(guān)鍵區(qū)域的基礎(chǔ)上,選取細小微胞藻Δ6脂肪酸脫飽和酶His I區(qū)和His II區(qū)域內(nèi)37個氨基酸殘基中的7組位點進行定點突變,研究結(jié)果證明MpFADS6中G194,E222,M227和V399/I400四組位點對底物的識別起重要作用;進一步選取高山被孢霉Δ6-I脂肪酸脫飽和酶中細胞色素b5區(qū)(HPGG)下游的5組位點進行定點突變,研究結(jié)果證明MaFADS6-I中K61和D68兩組位點對LA的催化作用有重要影響。從而找到Δ6脂肪酸脫飽和酶兩個關(guān)鍵區(qū)域中影響其催化活性的關(guān)鍵位點。4.偏好催化ω3系A(chǔ)LA的MpFADS6基因在高山被孢霉中的異源表達:首先以pBIG2-ura5s質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了MpFADS6的二元表達載體,然后利用根癌農(nóng)桿菌介導方法將MpFADS6基因整合至尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型高山被孢霉的基因組,通過對轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定得到了高山被孢霉重組菌株(Ma-MpFADS6)。5.高山被孢霉重組菌株應(yīng)用于EPA合成:在恒溫和變溫培養(yǎng)條件下,高山被孢霉重組菌中EPA產(chǎn)量分別為80.0 mg/L和90.4 mg/L;為了提高MpFADS6底物的含量,以游離型ALA為外源底物,高山被孢霉重組菌中EPA產(chǎn)量達到114.5 mg/L;考慮培養(yǎng)成本和游離型底物穩(wěn)定性的因素,以富含ALA的牡丹籽油(PSO)和牡丹籽粕(PSM)為外源底物,高山被孢霉重組菌中EPA產(chǎn)量分別達到149.3 mg/L和515.29 mg/L;在外源添加50 g/L PSM于5升發(fā)酵罐發(fā)酵16天后,高山被孢霉重組菌株中EPA產(chǎn)量達到588.5 mg/L,占總脂的7.8%,比原始菌株(0.8%)提高了9.8倍,利用分批補料發(fā)酵方法發(fā)酵16天后,高山被孢霉重組菌株中EPA產(chǎn)量提升至638.5 mg/L,比原始菌株(22.5mg/L)提高了28.4倍,成功實現(xiàn)了在高山被孢霉中通過ω3脂肪酸合成途徑生產(chǎn)EPA。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q55;TQ925

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本文編號：2451577