【摘要】：p53家族在個(gè)體發(fā)育、腫瘤抑制與發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等方面有非常重要的作用。p53家族成員(p53、p63和p73蛋白)之間有較高的序列相似性,在DNA結(jié)合域上p73與p53蛋白有63%的相似度,p63與p53蛋白有60%的相似度,這也暗示著這三種蛋白能夠結(jié)合至相同的DNA序列來(lái)轉(zhuǎn)錄激活同一靶基因,已有研究證明p53家族蛋白都能參與調(diào)控某些基因。著名抑癌因子p53蛋白在DNA損傷下被激活且聚集在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因,抑制細(xì)胞周期或促進(jìn)細(xì)胞凋亡等從而維持基因組的穩(wěn)定性。但現(xiàn)有研究已經(jīng)證明p53卻抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù)(DSB),似乎與其抑癌功能相悖。近年來(lái)已證明p53基因可編碼多種異構(gòu)體,它們可以協(xié)同或拮抗p53調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路,但對(duì)其功能和生物學(xué)意義的研究才剛剛開始。p53異構(gòu)體斑馬魚△113p53以及其在人細(xì)胞中的同源蛋白△133p53缺失全部的轉(zhuǎn)錄激活域和部分的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,保留全部的多聚體結(jié)構(gòu)域,它是p53的靶基因,能特異地拮抗p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有意思的是它僅被γ-射線照射激活,不被UV和熱激激活,那么△113p53/△133p53乃是否在DNA雙鏈斷裂中起著重要的作用呢?本論文第一部分工作從以下兩個(gè)方面探討了這個(gè)科學(xué)問題,具體結(jié)果如下：1)發(fā)現(xiàn)△113p53/A133p53促進(jìn)]NHEJ、HR和SSA三種DNA DSB修復(fù)途徑。首先我們觀察到△113p53/△133p53只能被DNA雙鏈斷裂損傷脅迫誘導(dǎo)表達(dá),然后在斑馬魚和人類細(xì)胞系中,采用NHEJ、HR和SSA三種修復(fù)分析系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)△113p53/神經(jīng)△A133p53對(duì)此三種修復(fù)方式都起著促進(jìn)作用,并不依賴于全長(zhǎng)p53。此種促進(jìn)作用是通過(guò)提高DSB修復(fù)關(guān)鍵基因Lig4、RadS1以及Rad52的表達(dá)來(lái)進(jìn)行的。2)p73協(xié)同A133p53促進(jìn)DNA DSB修復(fù)�！�133p53蛋白缺失轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,卻能轉(zhuǎn)錄激活Lig4、Rad51和Rad52的表達(dá)而不依賴于p53,那么這又是怎樣發(fā)生的呢?已知p53家族之間都具有類似的寡聚化結(jié)構(gòu)域,不同的異構(gòu)體可能形成異源多聚體。所以我們檢測(cè)在DNA DSB下p53其它家族成員的激活表達(dá),發(fā)現(xiàn)p73蛋白也可以被DNA雙鏈斷裂脅迫激活,且與△133p53表達(dá)時(shí)期一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)△133p53促進(jìn)DNADSB修復(fù)是依賴于p73,在DNA DSB脅迫下,敲低p73會(huì)增加DNA損傷積累以及加速細(xì)胞衰老。免疫共沉淀顯示它們?cè)隗w內(nèi)可以形成蛋白復(fù)合物。染色質(zhì)免疫共沉淀揭示△133p53促進(jìn)p73結(jié)合到修復(fù)相關(guān)基因Lig4、Rad51、Rad52基因啟動(dòng)子處,進(jìn)而激活它們的表達(dá),促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)。我們首次發(fā)現(xiàn)了△133p53和p73基因在DNA雙鏈斷裂修復(fù)的作用,同時(shí)也解開了全長(zhǎng)p53抑制DNA DSB修復(fù)的困惑。本論文第二部分工作是斑馬魚1號(hào)染色體22種基因敲除。CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展極大降低了大規(guī)模開展斑馬魚基因敲除的成本。為創(chuàng)建中國(guó)自己的斑馬魚突變體庫(kù),使國(guó)內(nèi)斑馬魚同行廣泛受益,同時(shí)提升中國(guó)斑馬魚領(lǐng)域科學(xué)家的國(guó)際影響力和話語(yǔ)權(quán),中國(guó)科學(xué)家組成了大規(guī)模敲除斑馬魚1號(hào)染色體基因的聯(lián)盟。在斑馬魚一號(hào)染色體整基因敲除計(jì)劃中,利用CRISPR-Cas9技術(shù),成功構(gòu)建了22個(gè)基因敲除突變體。這些材料最終都會(huì)免費(fèi)通過(guò)國(guó)家斑馬魚資源中心向國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界公開。通過(guò)對(duì)于這些基因的逐個(gè)敲除,我們可以進(jìn)一步破解這些基因的功能,從而建立各種發(fā)育與疾病模型,最終希望通過(guò)這些模型研究與人類相關(guān)的發(fā)育和疾病研究等。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2433786