【摘要】：長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA,它們沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的能力,具有多樣性的基因表達(dá)調(diào)控功能,可以在表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等不同層次對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。lncRNA具有多樣的核質(zhì)分布,根據(jù)其核質(zhì)分布的不同其調(diào)控功能也具備多種作用模式,包括介導(dǎo)調(diào)控蛋白質(zhì)分子到調(diào)控位點(diǎn)的順式調(diào)控模式和反式調(diào)控模式、通過(guò)影響調(diào)控蛋白質(zhì)分子活性改變靶基因的修飾水平和表達(dá)水平的調(diào)控模式,以及作為誘餌阻止其結(jié)合的調(diào)控蛋白質(zhì)分子同靶點(diǎn)結(jié)合的模式等。因此,基于lncRNA不同的核質(zhì)分布模式去探索其調(diào)控模式具有重要意義。同時(shí),lncRNA的核質(zhì)分布在特定應(yīng)激條件下(如DNA損傷等)是否會(huì)發(fā)生改變?這種改變是否具有生物學(xué)意義?是否依賴于lncRNA同特定蛋白的結(jié)合?對(duì)這些科學(xué)問(wèn)題的深入研究將有助于揭示未知lncRNA的功能以及新的調(diào)控機(jī)制。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,p53蛋白可以通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域特定DNA序列結(jié)合進(jìn)而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。大量研究表明,p53基因是重要的抑癌基因,在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)面對(duì)各種應(yīng)激信號(hào)時(shí),p53蛋白也受到多種調(diào)控機(jī)制的調(diào)控。這其中既有蛋白分子調(diào)控p53的表達(dá)和穩(wěn)定性,也有RNA分子參與其中。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)證明多種lncRNA,如LincRNA-p21、PANDA、MALAT1等,也參與到了p53的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,并影響其下游基因的表達(dá)。那么是否有新的lncRNA參與到p53蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中?是否lncRNA可以介導(dǎo)p53蛋白同其他蛋白之間的直接相互作用?這些科學(xué)問(wèn)題同樣需要進(jìn)一步研究。核不均一核糖核蛋白(hnRNP)是一類重要的RNA結(jié)合蛋白,在細(xì)胞內(nèi)可以同多種蛋白質(zhì)及RNA分子相互作用,調(diào)控mRNA前體的可變剪接,在mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)及mRNA的識(shí)別分類等方面具有重要的生物學(xué)功能。一些hnRNP參與到了p53蛋白功能調(diào)控中,如hnRNPK可以調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄活性,當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí)hnRNPK與p53協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),亦有研究表明lncRNA可以通過(guò)結(jié)合與p53的相互作用的hnRNP進(jìn)而調(diào)控p53本身的功能,如lncRNA Apela削弱hnRNPL蛋白與p53蛋白的結(jié)合能力,增加p53蛋白水平及p53蛋白的線粒體分布等。實(shí)驗(yàn)室前期工作證明hnRNPC與p53蛋白直接相互作用,且可以調(diào)節(jié)p53蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性,同時(shí)二者相互作用受到RNA的阻抑。基于此,尋找出削弱p53和hnRNPC直接相互作用的lncRNA,并對(duì)其功能展開(kāi)研究,有助于揭示lncRNA在p53及其相互作用蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。hnRNPC是重要的RNA結(jié)合蛋白,它在細(xì)胞中的含量非常高,且主要分布在細(xì)胞核內(nèi),這要求潛在的lncRNA除了能夠和hnRNPC結(jié)合也需要在細(xì)胞內(nèi)要有較高的表達(dá)水平,同時(shí)在特定條件下在細(xì)胞核內(nèi)具有分布。因而首先采用生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選出削弱hnRNPC同p53蛋白相互作用的lncRNA。通過(guò)將hnRNPC的CLIP數(shù)據(jù)庫(kù)中與之結(jié)合lncRNA的水平和p53+/+HCT116細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平相結(jié)合,篩選到了SNHG1這條具有較高表達(dá)水平且可能同hnRNPC結(jié)合的lncRNA。通過(guò)阿霉素處理p53+/+HCT116細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)SNHG1可以發(fā)生核駐留;通過(guò)hnRNPC的RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明SNHG1可以同hnRNPC結(jié)合;通過(guò)SNHG1的RNA pulldown實(shí)驗(yàn)證明SNHG1 657-667 bp的連續(xù)U區(qū)域是結(jié)合hnRNPC的關(guān)鍵區(qū)域;通過(guò)hnRNPC同p53蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)及GST pulldown實(shí)驗(yàn)證明,SNHG1可以削弱hn RNPC同p53蛋白之間的直接相互作用,而缺失了hnRNPC結(jié)合能力的SNHG1Del則不影響hnRNPC同p53蛋白的結(jié)合。通過(guò)一系列SNHG1的截短體與缺失體過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)合阿霉素處理證明SNHG1的498-509 bp區(qū)域?qū)Π⒚顾卣T導(dǎo)的SNHG1核駐留至關(guān)重要,而該區(qū)域也是SNHG1與NCL蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)干涉NCL并進(jìn)行阿霉素誘導(dǎo)進(jìn)一步證明SNHG1與NCL的結(jié)合對(duì)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的SNHG1核駐留至關(guān)重要。為了研究SNHG1核駐留導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng),通過(guò)在細(xì)胞核內(nèi)過(guò)表達(dá)SNHG1模擬阿霉素條件下SNHG1核駐留情況�；诤藘�(nèi)表達(dá)載體snoVector構(gòu)建SNHG1及缺失hnRNPC結(jié)合位點(diǎn)的SNHG1Del的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)載體,成功實(shí)現(xiàn)了核內(nèi)過(guò)表達(dá)SNHG1;通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)SNHG1非SNHG1Del可以上調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄活性;通過(guò)檢測(cè)p53蛋白半衰期發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)SNHG1而非SNHG1Del可以增強(qiáng)p53蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)而上調(diào)p53蛋白水平;通過(guò)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)SNHG1而非SNHG1Del可以抑制細(xì)胞增殖;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)SNHG1而非SNHG1Del促進(jìn)p53依賴的細(xì)胞凋亡。已有文獻(xiàn)報(bào)道SNHG1在非小細(xì)胞肺癌和肝癌中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能,這是否暗示了正常狀態(tài)下,定位于細(xì)胞質(zhì)的SNHG1也具有促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的功能?通過(guò)檢索腫瘤樣本lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)SNHG1在多種人腫瘤組織中的表達(dá)水平都高于癌旁組織,而在多個(gè)結(jié)腸癌樣本的數(shù)據(jù)中SNHG1表達(dá)水平也高于癌旁樣本。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),干涉SNHG1可以上調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄活性;通過(guò)p53蛋白的Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),干涉SNHG1可以增加p53蛋白水平;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)干涉SNHG1可以促進(jìn)p53依賴的細(xì)胞凋亡。通過(guò)SNHG1的RNA pulldown結(jié)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)SNHG1可能和NCL、ILF3等蛋白結(jié)合,而它們是p53重要的結(jié)合蛋白及調(diào)控蛋白,這可能是SNHG1在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中調(diào)控p53蛋白的分子機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。因而可以推斷在人結(jié)腸癌中SNHG1可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能。綜上所述,本研究的創(chuàng)新點(diǎn)和結(jié)論如下:1.首次證實(shí)了在阿霉素作用條件下長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG1可以發(fā)生細(xì)胞核駐留,且這種核駐留依賴于SNHG1同NCL蛋白的結(jié)合。2.首次證實(shí)SNHG1可以結(jié)合hnRNPC,并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hnRNPC削弱hnRNPC與p53蛋白的直接相互作用,發(fā)現(xiàn)了lncRNA調(diào)控蛋白質(zhì)分子相互作用的新模式。3.利用細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)載體在細(xì)胞核內(nèi)過(guò)表達(dá)SNHG1,以模擬阿霉素誘導(dǎo)的SNHG1細(xì)胞核駐留,揭示了核駐留的SNHG1可以增加p53蛋白穩(wěn)定性,提高p53蛋白水平、轉(zhuǎn)錄活性與磷酸化水平,促進(jìn)p53依賴的細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。4.揭示了在非DNA損傷狀態(tài)下抑制SNHG1的表達(dá)能增加p53蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性。這說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)中的SNHG1對(duì)p53的調(diào)控作用與細(xì)胞核中的SNHG1不同,進(jìn)而提示了lncRNA的不同核質(zhì)定位可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 沈遠(yuǎn);阿霉素誘導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG1細(xì)胞核駐留削弱hnRNPC同p53相互作用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2017年

，

本文編號(hào)：2423391