【摘要】：小型嚙齒類動物小鼠(musculus),在地球上分布廣泛,種類繁多,并廣泛應(yīng)用于生物相關(guān)領(lǐng)域的研究。從第一個近交系小鼠品系(DBA)培育至今,并伴隨著各類小鼠資源的不斷發(fā)展和積累,小鼠已成為最重要的模式動物,小鼠遺傳學(xué)也儼然成為一個重要的研究領(lǐng)域。隨著小鼠遺傳學(xué)的不斷發(fā)展,小鼠遺傳學(xué)研究也從單基因研究步入多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀研究。迄今,雖然已在小鼠基因組中定位大量調(diào)控復(fù)雜性狀的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci,QTL),但其中僅有小部分基因被成功定位克隆。研究表明,小鼠QTL精細(xì)定位和復(fù)雜性狀相關(guān)功能基因定位克隆之所以進(jìn)展緩慢的主要原因:1)傳統(tǒng)QTL定位方法耗時、耗力,分辨率低:QTL初步定位區(qū)段大(20~40c M),通過構(gòu)建同類系及反復(fù)雜交積累重組事件(幾年時間)實現(xiàn)QTL的精細(xì)定位(1~2c M);2)QTL精細(xì)定位困難:現(xiàn)有實驗小鼠起源單一,等位基因數(shù)量少;遺傳多樣性匱乏,連鎖不平衡程度高;只有100多年的歷史,累積重組事件少。綜合上述原因?qū)е滦∈驫TL精細(xì)定位及復(fù)雜性狀相關(guān)基因定位克隆極其困難。為克服上述問題,為小鼠遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ),本論文首次以中國地區(qū)野生小家鼠為研究對象,主要開展以下三個方面的工作:部分一:構(gòu)建野生小家鼠來源1號染色體替換群體。中國具有豐富的野生小家鼠資源,包括北方M.m.musculus和南方M.m.castaneus兩個亞種,且在長江流域具有較寬泛的亞種雜交地帶。具有豐富遺傳多樣性的野生小家鼠是復(fù)雜性狀研究的理想資源,但中國野生小家鼠的研究和利用相對滯后。而染色體替換系品系是基因挖掘、遺傳學(xué)和表觀遺傳性學(xué)及功能研究的重要策略之一。迄今小家鼠1號染色體上已初步定位超過1000個QTLs,僅有小部分基因被鑒定出來。為促進(jìn)小鼠1號染色體上已知QTL的精細(xì)定位,并進(jìn)一步定位克隆功能基因,為現(xiàn)有實驗室小鼠品系小鼠遺傳學(xué)研究增添新成員。本論文1)基于前期構(gòu)建的三組PCR-LDR分型系統(tǒng),快速篩選攜帶未重組1號染色體的小鼠個體用于回交,加速野生小家鼠來源1號染色體替換群體(population of chromosome one substitution strains,PCSSs)的構(gòu)建進(jìn)程;2)構(gòu)建基于競爭性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(competitive polymerase chain reaction,c PCR)技術(shù)的拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)檢測方案,并結(jié)合三組PCR-LDR分型方案協(xié)同監(jiān)控野生小家鼠來源1號染色體的穩(wěn)定遺傳;3)采用兩步法自交方案,克服了小鼠大規(guī)模飼養(yǎng)和大量基因分型工作等多方面難點,實現(xiàn)PCSS各品系1號染色體的快速純化;4)采用全基因組芯片掃描技術(shù),實時監(jiān)控回交過程中各品系基因組背景純度,且染色體工程小鼠隨著回交代數(shù)的不斷增加小鼠基因組背景純度將逐漸提高。結(jié)合三組PCR-LDR分型方案、2步法自交方案和全基因組芯片掃描,最終成功建立25個1號染色體替換系品系。野生小家鼠來源PCSS群體填補(bǔ)了國內(nèi)外就中國野生小家鼠遺傳資源利用的空白,為現(xiàn)有實驗室小鼠品系添加新的成員。部分二:20個1號染色體替換系品系的遺傳質(zhì)量評估。2002年,近交系C57BL/6J(簡稱B6)的全基因組DNA序列信息的獲取,大力推動了小鼠正向遺傳學(xué)的發(fā)展。且隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展,小鼠基因組計劃利用高通量二代測序技術(shù)已完成36個近交系的基因組測序,通過深入解析品系間SNPs,In Dels,結(jié)構(gòu)變異(structure variations,SVs)等遺傳多樣性,并建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫,進(jìn)一步推動了小鼠遺傳學(xué)的快速發(fā)展,及小鼠進(jìn)化史和環(huán)境適應(yīng)性等方面的研究。在成功構(gòu)建中國野生小家鼠來源1號染色體替換系群體的基礎(chǔ)上,本論文1)采用Illumina Hiseq2500和Illumina Hiseq X Ten測序平臺,分別針對昆明白鼠來源和19個野生小家鼠來源1號染色體替換系品系完成全基因組重測序,平均測序深度均㧐30×。通過數(shù)據(jù)質(zhì)控,過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)和接頭后,獲得了充足有效、高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)用于后續(xù)生物統(tǒng)計學(xué)分析;2)采用speedseq軟件深入挖掘了20個品系的遺傳多樣型,共累積發(fā)現(xiàn)4.1×107個遺傳變異。其中B6-Chr1KM品系中的數(shù)量最少,只有7.61×105,而19個品系的野生小家鼠來源1號染色體上則含有大量遺傳多樣性,遠(yuǎn)超實驗小鼠。野生小家鼠來源1號染色體上平均含有的SNP數(shù)量為1.38×106(SNP密度為7.06個SNP/Kb),高于實驗小鼠群體(1.25個SNP/Kb)。并采用Variant Effect Predictor軟件完成各種遺傳變異的功能注釋,共發(fā)現(xiàn)2684個基因有可能受到影響。3)根據(jù)20個品系的SNP數(shù)據(jù):發(fā)現(xiàn)16個品系的1號染色體純合度均㧐98%,而B6-Chr1HZ、B6-Chr1TZ、B6-Chr1TZ和B6-Chr1TZ 4個品系的純合度分別為97.19%,91.90%,80.00%和75.96%,因此20個野生小家鼠來源1號染色體替換系品系適用于后續(xù)遺傳學(xué)研究的。4)在20個品系的基因組背景中,均殘留供體品系的遺傳信息(稱“Island”),其中B6-Chr1YX品系的基因組背景雜合度最低為0.27%,B6-Chr1ZZ2品系最高為6.46%。5)通過研究20個品系1號染色體的遺傳結(jié)構(gòu)說明,小家鼠作為人類伴生種在中國地區(qū)主要分布兩個亞種M.m.castaneus和M.m.musculus,且隨著人類活動的增加和頻繁流動,南北小家鼠彼此頻繁遷移和基因的相互滲透,形成一較大的雜交地帶。野生小家鼠來源1號染色體替換系群體的全基因組DNA序列信息的獲取及初步解析,填補(bǔ)了國內(nèi)外就中國地區(qū)野生小家鼠DNA序列信息的空白,是國內(nèi)外小鼠遺傳學(xué)研究的有益補(bǔ)充,為復(fù)雜性狀相關(guān)QTLs的精細(xì)定位和相關(guān)功能基因的定位克隆奠定了堅實基礎(chǔ)。部分三:PCSSs群體的表型鑒定及分析。模式動物小鼠是人類相關(guān)疾病研究的重要模型,并廣泛應(yīng)用于生理學(xué)和病理學(xué)研究中。小鼠遺傳學(xué)的最終目的是揭示與表型相關(guān)的功能基因,因此表型檢測始終是小鼠研究過程中至關(guān)重要的組成部分。后基因組時代,單一和簡單的表型檢測難以適用于復(fù)雜性狀相關(guān)的研究需要,因此針對復(fù)雜性狀開展廣泛的表型檢測工作受到了廣泛關(guān)注。本論文以B6-Chr1SJ,B6-Chr1ZZ2,B6-Chr1ZC,B6-Chr1TW,B6-Chr1SMX,B6-Chr1ZZ1,B6-Chr1CM,B6-Chr1HZ和B6-Chr1KM共9個1號染色體替換系品系為研究對象,采集了小鼠生長發(fā)育和生理生化等表型數(shù)據(jù),并建立了表型數(shù)據(jù)庫。通過統(tǒng)計學(xué)分析鑒別出與B6品系具有顯著星差異的染色體替換系品系及表型:如B6-Chr1KM(P=0.000)、B6-Chr1ZZ1(P=0.014)和B6-Chr1TW(P=0.031)的1日齡雌鼠體重與B6雌鼠具有顯著性差異,而其它品系與B6無顯著差異;B6-Chr1ZZ1、B6-Chr1TW、B6-Chr1SJ、B6-Chr1SMX和B6-Chr1ZZ2 5個野生小家鼠來源的替換品系的陰門開啟時間顯著高于B6,且具有顯著性差異(P㩳0.05);B6-Chr1CM、B6-Chr1SJ、B6-Chr1SMX和B6-Chr1ZZ24個品系的包皮脫落時間高于B6(P㩳0.05);B6-Chr1HZ雌鼠的ALP顯著高于B6(P=0.001),而B6-Chr1KM雄鼠則顯著低于B6(P=0.031);B6-Chr1CM雌鼠的ALT顯著高于B6(P=0.011);B6-Chr1CM(P=0.000)、B6-Chr1SMX(P=0.000)、B6-Chr1HZ(P=0.041)雄鼠的TB顯著高于B6;B6-Chr1SMX雄鼠的TG顯著高于B6(P=0.044);B6-Chr1TW雄鼠的TC顯著高于B6具有顯著差異(P=0.005)等。通過歸納整理表型數(shù)據(jù)并錄入表型數(shù)據(jù)庫,為研究染色體替換系群體的表型,深度挖掘QTL打下了良好的基礎(chǔ)。本論文針對當(dāng)前小鼠資源在復(fù)雜性狀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域中面臨的困難,在國內(nèi)外首次利用具有豐富遺傳多樣性和積累豐富重組事件的中國野生小家鼠,成功構(gòu)建野生小家鼠來源1號染色體替換系群體,深入探索20個品系野生小家鼠來源1號染色體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)和基因組背景信息,進(jìn)一步采集了9個1號染色體替換系品系的基礎(chǔ)表型和血液生化等表型數(shù)據(jù),并建立了野生來源小家鼠1號染色體替換系群體基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫。本論文研究結(jié)果顯示,20個野生小家鼠來源1號染色體替換系品系的1號染色體具有豐富的遺傳多樣性,且大量基礎(chǔ)表型和血液生化等表型與近交系品系B6具有顯著性差異。因此,PCSSs群體是復(fù)雜性狀研究的優(yōu)勢資源,PCSSs群體為小鼠遺傳學(xué)研究提供優(yōu)質(zhì)遺傳資源,也為后續(xù)QTL精細(xì)定位和相關(guān)基因定位克隆奠定堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：2422773