【摘要】：核酸在細胞的生長、發(fā)育及分化過程中起著關鍵的作用。長期以來,核酸微陣列芯片技術作為核酸檢測的重要手段,在高通量核酸分析領域發(fā)揮著巨大的作用。微陣列芯片利用經(jīng)過特殊化學修飾的寡核苷酸探針,可以在一次反應中同時進行數(shù)百個基因位點的檢測。但是,核酸微陣列芯片的靈敏度低,無法滿足低含量核酸的檢測需求。PCR技術,作為一種在體外對核酸分子進行擴增的技術,具有靈敏度高、準確率好以及反應高效等特點,成為應用最為廣泛的一種低含量核酸檢測手段。多重PCR是一種特殊形式的PCR,可在單次反應中進行多個目的核酸片段同步擴增,在基礎科研和臨床研究方面已經(jīng)有著廣泛的應用。傳統(tǒng)的多重PCR是在單個反應管中加入多對引物進行多個目的基因的并行擴增。這種方法具有一些局限性,主要表現(xiàn)在不同引物對之間的干擾和競爭使得各個目的基因較難均衡、有效地擴增,使得一次反應最多只能對10多重目的基因進行檢測。近些年來,微液滴操控技術得到快速的發(fā)展,并且已經(jīng)出現(xiàn)了多種形式的微液滴技術平臺。相比于傳統(tǒng)的試管反應體系,微液滴反應體系具有許多獨特的優(yōu)勢。首先,液滴的體積可小至納升級或皮升級,反應的試劑消耗量可降低3個數(shù)量級以上,大幅度減少實驗成本。其次,液滴之間被與之不互溶的另一相所間隔,每個液滴皆可作為獨立的微反應器,可以同時對多個樣品進行高通量平行分析。第三,微反應器內(nèi)液體混合速度快,熱傳遞效率高,能夠實現(xiàn)快速的生化反應,大幅減少反應時間,提高反應效率。第四,微反應器的尺寸與細胞體積相當,適合進行單細胞捕獲及操控,可實現(xiàn)單細胞的檢測分析。第五,微型化反應器有助于將樣品純化、混合、擴增、檢測等一系列操作整合到一起,使系統(tǒng)更易實現(xiàn)自動化、便攜化。目前,微液滴技術已經(jīng)廣泛應用于蛋白質檢測、酶動力學反應、PCR反應、單細胞研究等生物學檢測技術中,在生命科學研究領域展現(xiàn)出強大的應用潛力。本論文研究的內(nèi)容包括：1、基于親疏水模式的微液滴陣列芯片的制備本論文發(fā)展了一種極其簡單的方法來制作基于親疏水模式的微液滴陣列芯片。首先通過點樣的方式將含有親水性物質的溶液點樣至疏水性平整表面以形成微小的液滴陣列,而后將液滴干燥以除去微小液滴中的水分,使液滴中的親水性物質與疏水性平整表面相結合,形成親水性樣點陣列。之后將含有反應物的溶液點樣至親水性樣點處,并在其上覆蓋一層與水不互溶的油相物質,從而在各親水結合點處形成獨立的微小反應液滴。最后在設定的反應條件下,各微小反應液滴中的物質發(fā)生特定的生化反應。該方法克服了現(xiàn)有的微液滴芯片制作成本高、操作復雜、設備昂貴等問題,使多重并行反應處理系統(tǒng)能在普通實驗條件下實施,極大地擴展了其應用范圍。2、基于微液滴陣列芯片的多重PCR系統(tǒng)本論文將基于親疏水模式的微液滴陣列芯片與PCR技術相結合,在不同的親水樣點處預置特異的引物,建立了一種中等通量的多重核酸檢測系統(tǒng)。通過對PCR過程中的熒光信號進行實時監(jiān)測,實現(xiàn)了多重基因的并行定量分析。利用該系統(tǒng),在單張標準載玻片上,可以同時發(fā)生至少96個PCR反應。該系統(tǒng)的試劑消耗量極低,每個液滴的體積為500nl,僅相當于常規(guī)PCR實驗的四十分之一。PCR擴增的檢測線性范圍超過5個數(shù)量級。單個液滴的PCR擴增靈敏度低至1個分子,可進行數(shù)字PCR系統(tǒng)的開發(fā)研究。采用該系統(tǒng)進行多重PCR檢測,結果準確,且具有高度特異性。此外,該系統(tǒng)作為一種通用化的實時定量PCR平臺,不僅可用于多重DNA的分析,還可用于RNA的定量檢測,在定量生物學中具有廣泛的應用前景。3、基于恒溫擴增的多重核酸檢測技術本論文將親疏水模式的微液滴陣列芯片與滾環(huán)擴增技術相結合,建立了一種恒溫條件下的多重核酸檢測系統(tǒng),并且通過對滾環(huán)擴增過程中所產(chǎn)生的熒光信號進行實時監(jiān)測,可以實現(xiàn)對多個基因的定量分析。利用該技術平臺可進行SNP檢測,分辨率超過0.1%。該方法采用恒溫擴增的策略,不需要復雜的溫控裝置,更加節(jié)省能量并且具有更好的便攜性。整個系統(tǒng)的設計可以變得非常簡單,有利于進行系統(tǒng)的小型化開發(fā),在臨床診斷及現(xiàn)場檢測領域能夠發(fā)揮出巨大的潛力。
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【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q503

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本文編號：2409698