【摘要】：α-半乳寡糖在自然界中廣泛存在,具有許多重要的生物學(xué)功能,在功能食品及醫(yī)藥業(yè)有著重要的應(yīng)用價值。例如,豆奶中的不易消化的a-半乳寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物通常包含Galα1-6糖苷鍵,這些物質(zhì)不易被人或其他單胃動物消化,可以作為益生元(prebiotics)進入腸道選擇性的促進腸道有益菌群的生長。α-Gal抗原寡糖是一類末端含有Galα1-3糖苷鍵的糖鏈,是在非靈長類、原猴亞目、新世界猴等動物體內(nèi)廣泛存在的重要的糖抗原。在進行異種器官移植時,該抗原進入人體后可被人體內(nèi)的天然α-Gal抗體識別而引起強烈的免疫反應(yīng),甚至危及患者生命。在進行異種器官移植時,向患者體內(nèi)大量注射人工合成的α-Gal抗原寡糖或其衍生物能中和天然抗體,減弱免疫排斥反應(yīng)。另外,正由于人體中存在天然的α-Gal抗體,α-Gal抗原寡糖也可以用于癌癥疫苗的制備,以增加癌癥疫苗的免疫原性。另一種重要的α-半乳寡糖globotriose (Galα1-4Galβ1-4Glc),存在于人體細胞表面,是痢疾志賀氏桿菌(Shigella dysenteriae)和腸出血性大腸桿菌(EPEC)產(chǎn)生的志賀氏毒素的受體糖鏈,志賀氏毒素與globotriose結(jié)合會引起一系列毒性反應(yīng)及并發(fā)癥,最終引發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)導(dǎo)致患者死亡人工合成的globotriose及其衍生物可以模擬天然受體結(jié)構(gòu)并與毒素結(jié)合,可以作為親和抑制劑用于中和毒素及相關(guān)疾病的治療。此外,globotriose還是存在于腦癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌及小細胞肺癌等腫瘤細胞的神經(jīng)節(jié)苷脂如GloboH和SSEA4糖鏈的核心結(jié)構(gòu),因此可作為癌癥相關(guān)糖抗原的合成前體用于癌癥疫苗的研發(fā)。最近的研究發(fā)現(xiàn),細胞表面或者可溶性的Pk/Gb3組織血型抗原末端的半乳雙糖(Galα1-4Gal)結(jié)構(gòu)或者類似物可以通過與HIV-1病毒的包膜蛋白結(jié)合以抑制病毒在靶細胞表面的吸附,揭示了globotriose及其衍生物可以作為新的治療方法用于HIV/AIDS的治療的可能。雖然寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物應(yīng)用于食品和藥品具有巨大的潛能,但是由于這些生物分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而導(dǎo)致其大量制備十分困難。目前寡糖的合成方法包括化學(xué)法及酶法合成。由于糖分子中多個可以參與反應(yīng)的羥基,化學(xué)法合成特定的糖苷鍵需要多步的保護及去保護操作,步驟繁瑣。而酶法合成糖苷鍵一步完成,可以在不對其它羥基進行保護的情況下保證合成的區(qū)域選擇性和立體選擇性,步驟簡單,而且可以在不對其它羥基進行保護的情況下保證合成的區(qū)域選擇性和立體選擇性,因而在寡糖合成方面具有一定優(yōu)勢。一步法合成寡糖反應(yīng)中應(yīng)用的兩類酶分別是糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases)和糖苷酶(glycosidases)。糖基轉(zhuǎn)移酶是生物體內(nèi)天然合成寡糖或者聚糖的酶,立體選擇性和區(qū)域選擇性好,反應(yīng)效率高,但是糖基轉(zhuǎn)移酶需要價格昂貴的活化的糖核苷酸作為糖基供體,不利于體外規(guī)�；铣煞磻�(yīng)。糖苷酶又稱為糖苷水解酶,通常是天然條件下對聚糖或者糖綴合物上的糖苷鍵進行水解的一類酶,但是某些種類的糖苷酶在體外條件下,也可以利用簡單糖類為糖基供體催化糖基化反應(yīng)(glycosylation)或者轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(transglycosylation)合成糖苷鍵,生成各類糖類化合物。由于糖苷酶催化糖苷鍵合成的糖基供體可以為單糖、寡糖及其他糖苷類化合物,因此可以低成本、大規(guī)模的合成寡糖及其衍生物,因而該類酶的合成能力受到廣泛關(guān)注。α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是一類重要的糖苷酶,該酶天然情況下可以水解除去多種寡糖或者糖綴合物末端的半乳糖基。根據(jù)氨基酸序列相似性,α-半乳糖苷酶歸屬于糖苷酶家族GH4、GH27、GH36、GH57、GH97和GH110(http://www.cazy.org/)。已有具有轉(zhuǎn)糖基活性的α-半乳糖苷酶應(yīng)用于半乳寡糖和糖苷的合成報道,大部分已知的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶能夠催化合成Galα1-3或者Galα1-6糖苷鍵,只有極少數(shù)α-半乳糖苷酶能夠催化合成Galα1-4糖苷鍵,包括水蘇屬(Stachys affinis)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) 100-16/100-23來源的α-半乳糖苷酶以及本實驗室報道的來源于短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)203的α-半乳糖苷酶。目前僅有短雙歧桿菌的酶能以甲基乳糖苷為受體催化合成globotriose衍生物,但區(qū)域選擇性不嚴格,合成兩種異構(gòu)產(chǎn)物。因而篩選新的具有轉(zhuǎn)糖基活性、區(qū)域選擇性專一的α-半乳糖苷酶對于藥用寡糖及糖綴合物的合成具有重要意義。本論文首先進行了具有轉(zhuǎn)糖基活性的α-半乳糖苷酶的篩選,目標是以乳糖為糖基受體篩選獲得能夠合成Galal-4糖苷鍵的糖苷酶。通過TAIL-PCR技術(shù)和常規(guī)PCR技術(shù)克隆了不同微生物來源的9個α-半乳糖苷酶基因,即干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) JCM1134 α-半乳糖苷酶基因agaLc (2295 bp),短乳桿菌(Lactobacillus breve) JCM1059 α-半乳糖苷酶基因agaLb737 (2214 bp),產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens) ATCC13124 α-半乳糖苷酶CPF 0491基因(2205bp),以及脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis) NCTC 9343來源的α-半乳糖苷酶BF1418、BF4189、BF0233、BF0498、BF0803、BF0227基因(大小分別為1503bp、1491 bp、2160 bp、2169 bp、2076 bp、1593 bp)。將這些α-半乳糖昔酶基因與pBAD/His A載體連接轉(zhuǎn)化表達宿主E. coli LMG194,構(gòu)建基因工程菌用于重組酶的誘導(dǎo)表達。9個重組α-半乳糖苷酶均可以表達出可溶性蛋白,重組酶粗酶液均表現(xiàn)出對對硝基半乳糖苷(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside,pNPαGal)的水解活性。用重組酶粗酶液催化以pNPaGal為供體、乳糖為受體的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)研究結(jié)果說明,除BF0803外,其余8個重組酶均可以催化合成以乳糖為受體的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物。其中CPF 0491、BF0233和BF0227合成的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物經(jīng)TLC檢測與globotriose標準品遷移率一致,轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進一步經(jīng)高效陰離子交換色譜(HPAEC)檢測,發(fā)現(xiàn)只有BF0227的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物與globotriose標準品保留時間一致。對轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進行乙�；揎�,NMR分析結(jié)構(gòu)表明該產(chǎn)物為半乳糖以α1-4糖苷鍵與乳糖連接的寡糖,這是首例可以以天然乳糖為受體催化合成Galα1-4糖苷鍵的α-半乳糖苷酶,因此后續(xù)的研究工作均圍繞BF0227開展。進一步研究表明,由于重組酶BF0227在已經(jīng)構(gòu)建的大腸桿菌表達系統(tǒng)中無法實現(xiàn)Ni-親和層析純化。該酶基因大小為1593 bp,編碼約58.3KDa的蛋白,屬于GH27家族,根據(jù)SignalP4.1分析,其N-端的24個氨基酸為預(yù)測的理論信號肽序列。進而克隆BF0227基因去除的N-端信號肽編碼的核苷酸序列,命名為agaBf3S,構(gòu)建基因工程菌E. coli LMG194/pBAD/His A-agaBf3S,對重組酶AgaBf3S進行誘導(dǎo)表達,經(jīng)過Ni-親和層析純化得到AgaBf3S純酶,分子量約59.2kDa。對其進行酶學(xué)性質(zhì)研究,在進行水解反應(yīng)時,AgaBf3S最適pH 4.5,在pH4.0-11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定,最適溫度40℃,溫度高于40℃時迅速失活。重組酶AgaBf3S受各種離子的影響較小,為非離子依賴的酸性中溫糖苷酶。AgaBf3S可高效水解pNPαGal,當以oNPαGal底物時,其水解活力為pNPαGal水解活力的37.58%,對其它底物如mNPaGal、β-糖苷鍵連接底物或非半乳糖硝基苯糖苷均沒有水解活性。對AgaBf3S水解人工及天然底物的Km和kcat分別進行的測定結(jié)果表明,AgaBf3S水解pNPαGal、蜜二糖和globotriose的Km和kcat值分別為1.27mM和172.97 S-1,62.76 mM和7.74 S-1,4.62 mM和388.45 S-1; AgaBf3S水解pNPaGαl、蜜二糖和globotriose的kcat/Km值分別為135.88 mM-1S-1,0.28 mM-1S-1, 84.12mM-1S-1。以上三種底物中,AgaBf3S對pNPαGal的親和力和水解效率均最高,說明pNPαGal較合適作為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)供體。將AgaBf3S以pNPaGal為供體、以乳糖為受體進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng),并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化,研究了底物濃度、pH、溫度等對產(chǎn)物產(chǎn)率的影響,確定產(chǎn)物產(chǎn)率最高的反應(yīng)條件為：起始乳糖濃度500 mM、pNPαGal濃度20 mM、酶濃度0.6 U/mL,在100 mM pH 4.5NaAc緩沖液中40℃反應(yīng)30 min,此時產(chǎn)物(命名為PLac)產(chǎn)率為32.4%。對產(chǎn)物進行分離純化,并將其1H NMR譜及1H,13C-HSQC譜與globotriose的標準品的相關(guān)譜圖進行比較,結(jié)合TLC遷移率、質(zhì)譜結(jié)果、HPAEC保留時間分析,確定該轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物為globotriose。該結(jié)果顯示AgaBf3S是一步法合成globotriose的新型工具酶。進一步研究了該酶的轉(zhuǎn)糖基受體選擇性,以多種二糖、單糖和糖醇為受體建立轉(zhuǎn)糖基反應(yīng),結(jié)果表明AgaBf3S可以在纖維二糖、麥芽糖、蜜二糖等二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖等醛糖為受體時合成轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物,并且受體非還原端為半乳糖時產(chǎn)物產(chǎn)量較高,在以山梨糖、果糖等酮糖,甘露醇、山梨醇等糖醇以及木糖和鼠李糖為受體時無轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物生成,說明糖基受體糖環(huán)結(jié)構(gòu)、羥基位置,尤其是C-4上羥基的鍵型對于AgaBf3S的受體選擇性具有十分重要的影響。進一步通過隨機突變與定點突變相結(jié)合的方式獲得了轉(zhuǎn)糖基效率提高的突變酶,同時對AgaBf3S受體選擇性相關(guān)的氨基酸位點進行了研究。α-半乳糖苷酶催化合成反應(yīng)時遵循糖苷酶的一般作用機制,在反應(yīng)后期還會對轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進行二次水解,因此產(chǎn)物產(chǎn)量不高。為了提高AgaBf3S催化合成globotriose的產(chǎn)率,對AgaBf3S進行了隨機突變研究,確定了2個對轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)率有較大影響的氨基酸位點,并對這兩個氨基酸位點進行了不同類型的氨基酸替換,最終得到了突變酶A141W和H426S,其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)率分別為36.06%和38.25%,與原始酶(產(chǎn)率為32.4%)相比,產(chǎn)率分別提高了11%和18%。通過對AgaBf3S進行同源模建(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index,模板為鏈霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680)來源的β-L-阿拉伯糖苷酶Arap27A),根據(jù)其三維模擬結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),A141位于催化腔的腔口,可能是由于該位點的丙氨酸突變成了非極性的色氨酸后導(dǎo)致反應(yīng)腔內(nèi)水活度降低,轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物可以大量積累。通過結(jié)構(gòu)比對,推測出多個與AgaBf3S催化活性相關(guān)的重要氨基酸位點,其中D135為親核位點,D191為酸堿催化位點,D48、K133、C170、R187為底物結(jié)合位點,Y101、W172、P194為推測的配體結(jié)合位點。通過氨基酸定點突變進一步確定了W172為受體結(jié)合相關(guān)位點,該位點的色氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?可以以pNPαGal為受體合成大量自轉(zhuǎn)產(chǎn)物,而原始酶不以pNPαGal為受體合成自轉(zhuǎn)產(chǎn)物,說明該位點氨基酸的替換改變了酶的受體選擇性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55
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本文編號：2383175