【摘要】：一、研究背景與目的軟骨是人和脊椎動(dòng)物特有的胚胎性骨骼,一種無血管組織�？煞譃橥该鬈浌�、彈性軟骨和纖維軟骨,為一種略帶彈性的堅(jiān)韌組織。軟骨是由軟骨細(xì)胞、纖維和軟骨基質(zhì)構(gòu)成。在胎兒和年幼期,軟骨組織分布較廣,后來逐漸被骨組織代替。成年人軟骨存在于骨的關(guān)節(jié)面、肋軟骨、氣管、耳廓、椎間盤等處。同時(shí)軟骨的發(fā)生是胚胎發(fā)育的重要環(huán)節(jié),軟骨的正常發(fā)育最終生成了所有的長(zhǎng)骨,它的正常發(fā)育不僅對(duì)形成正常形態(tài)和長(zhǎng)度的骨骼極為重要,其發(fā)育對(duì)附著于其上的神經(jīng)肌肉的正常發(fā)育也是至關(guān)重要。由于動(dòng)物體內(nèi)的長(zhǎng)骨都是通過軟骨內(nèi)成骨過程而產(chǎn)生的,所以軟骨內(nèi)成骨的過程顯得十分重要。長(zhǎng)骨的發(fā)生會(huì)經(jīng)過一系列的過程。首先是間充質(zhì)細(xì)胞聚集然后分化出骨原細(xì)胞,后者分化出軟骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞不停的向四周分泌以Ⅱ型膠原為主的軟骨基質(zhì),軟骨細(xì)胞繼而被包埋在軟骨基質(zhì)中,形成軟骨組織即軟骨雛形。軟骨雛形中段外圍首先出現(xiàn)骨質(zhì)的形成,首先是軟骨膜深層形成血管,其周邊的骨原細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞就開始生成并沉淀類骨質(zhì),自身因?yàn)楸活惞琴|(zhì)包埋而成為成骨細(xì)胞。軟骨雛形中段外圍首先出現(xiàn)骨質(zhì)沉淀,形成骨領(lǐng)即最初的長(zhǎng)骨皮質(zhì),軟骨雛形中段隨后出現(xiàn)血管的侵入,成骨細(xì)胞的分化以及破骨細(xì)胞的侵入,使得初級(jí)骨化中心得以形成；類似的是長(zhǎng)骨兩端也繼而出現(xiàn)同樣的生理過程,次級(jí)骨化中心最終得以出現(xiàn)。初級(jí)骨化中心和次級(jí)骨化中心之間的就是生長(zhǎng)板。生長(zhǎng)板中軟骨細(xì)胞呈規(guī)律的柱狀排列,分為靜息期軟骨細(xì)胞、增殖期軟骨細(xì)胞、肥大期軟骨細(xì)胞。肥大軟骨細(xì)胞最終分化為終末肥大軟骨細(xì)胞,其分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)分解軟骨基質(zhì),血管生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)血管的長(zhǎng)入,帶來成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,最終在共同作用下生成新生骨質(zhì)。而后天的長(zhǎng)骨長(zhǎng)度,很大程度上就取決于生長(zhǎng)板中軟骨細(xì)胞的規(guī)律增殖分化。調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞規(guī)律增殖分化的最重要通路是印猬蛋白-甲狀旁腺激素相關(guān)肽(IHH-PTHrP)信號(hào)軸。生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中,前肥大期軟骨細(xì)胞分泌IHH,其直接作用于前肥大細(xì)胞周邊的軟骨膜,促使其中的軟骨膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。同時(shí),其作用于增殖期軟骨細(xì)胞,直接促進(jìn)其增殖,使得軟骨柱延長(zhǎng)。再者,IHH可以刺激靜息期軟骨細(xì)胞分泌PTHrP, PTHrP作用于增殖期軟骨細(xì)胞及前肥大軟骨細(xì)胞,抑制其向肥大軟骨細(xì)胞分化,保持增殖狀態(tài)。因而在生長(zhǎng)板中IHH-PTHrP分子的共同作用下,軟骨細(xì)胞得以有規(guī)律的增殖、分化。mTOR是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(the mechanistic target of rapamycin, mTOR)是整合細(xì)胞內(nèi)外各種信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝的中心信號(hào)分子。其mTOR復(fù)合物1(mTORCl)通路的活性也是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、增殖、凋亡的重要因素。軟骨組織作為區(qū)別于其他組織的獨(dú)立組織,其發(fā)生、發(fā)育過程是在一個(gè)在低氧的狀態(tài)下間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化、增殖、分化的生理過程。生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞處在一個(gè)低營(yíng)養(yǎng),低血氧濃度的狀態(tài),它們是如何在這樣的情況下分泌膠原、增殖分化,完成相關(guān)的生理功能的尚有待研究。近年來,針對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：軟骨增殖分化過程與Wnt, mTOR等多條細(xì)胞分子信號(hào)通路相關(guān)。近年來已有若干研究將焦點(diǎn)聚集在mTOR信號(hào)通路調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖分化的機(jī)制上,并發(fā)現(xiàn)mTOR特異性抑制劑,能抑制軟骨細(xì)胞的增殖與分化。亦有研究證實(shí)雷帕霉素能夠抑制接受治療的幼兒長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)發(fā)育。有報(bào)道稱mTOR通路活性在軟骨發(fā)育中出現(xiàn)了改變。但是目前多項(xiàng)研究尚不深入,mTOR扮演著何種調(diào)控角色尚不明確,mTOR調(diào)控軟骨生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間點(diǎn)及其效應(yīng)如何尚未見報(bào)道。而mTOR通路是如何影響軟骨細(xì)胞的規(guī)律增殖分化進(jìn)而影響了長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)尚有待研究。二、目的本課題主要研究了以下內(nèi)容：1、軟骨細(xì)胞增殖分化過程中mTORC1通路活性的變化。2、雷帕霉素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖分化的影響。3、軟骨細(xì)胞mTORC1通路過度活化對(duì)于小鼠軟骨內(nèi)成骨的影響。4、mTORC1通路如何調(diào)控PTHrP來控制軟骨細(xì)胞增殖分化。三、材料方法1、體內(nèi)軟骨細(xì)胞增殖分化時(shí)mTORC1通路活性的變化情況。利用免疫熒光觀察mTORC1通路活性指標(biāo)蛋白磷酸化核糖體S6蛋白(pS6)在小鼠E14.5天肱骨,以及P7、P18天脛骨中的表達(dá)情況。利用Western blots來分析培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞在誘導(dǎo)分化的過程中pS6蛋白的變化情況。利用免疫熒光觀察mTORC1上游抑制蛋白TSC1來研究mTORC1通路活性變化情況。2、雷帕霉素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖分化的影響。繪制不同濃度雷帕霉素處理過后的軟骨細(xì)胞的增殖曲線。雷帕霉素處理過后原代軟骨細(xì)胞,通過qPCR來分析軟骨分化相關(guān)指標(biāo)Co110al、MMP13、IHH mRNA的變化情況。給予孕鼠腹腔注射雷帕霉素三天后,取材觀察P0天小鼠的脛骨發(fā)育情況,分析切片的蘇木素-伊紅染色(HE染色)、pS6的免疫熒光、MMP13的原位雜交,來分析雷帕霉素是如何對(duì)軟骨細(xì)胞分化造成影響。具體分析HE切片上顯示的增殖區(qū),肥大區(qū)長(zhǎng)度來判斷雷帕霉素是如何影響到增殖和肥大進(jìn)程的。3、軟骨細(xì)胞過度激活的mTORC1通路的軟骨細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠的軟骨細(xì)胞增殖、分化情況。利用Cre-Loxp系統(tǒng),我們構(gòu)建出軟骨細(xì)胞特異性敲除TSC1基因的小鼠(TSC1CKO)。通過western blots分析TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞mTORC1通路激活情況。通過免疫熒光分析P0天TSC1CKO小鼠和對(duì)照小鼠肱骨的pS6變化情況。測(cè)量TSC1CKO小鼠和TSC1flox/flox小鼠的身長(zhǎng)的差異以及肱骨、股骨、脛骨的差異。分析P0、2W、4W、8W、12W小鼠脛骨切片HE染色的組織學(xué)差異。4、過度激活的mTORC1通路的TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞增殖情況。TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠肋骨切片的HE染色。給予P0天TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠注射BrdU,2h后取材并切片行BrdU免疫熒光,觀察TSC1基因敲除對(duì)于小鼠軟骨增殖的影響。取TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的脛骨及肋軟骨,研磨后提取蛋白,行western blots分析增殖相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、核增殖抗原PCNA的變化。利用免疫組織化學(xué)來分析Cyclin B1在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨的表達(dá)情況。使用CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠軟骨原代細(xì)胞的增殖情況。5、TSC1CKO小鼠表現(xiàn)出肥大分化減慢,終末肥大分化受到抑制。利用原位雜交顯示Col10al的mRNA在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長(zhǎng)板上的表達(dá)情況。HE切片分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長(zhǎng)板的肥大分化情況。利用BrdU Chase實(shí)驗(yàn)追蹤增殖期軟骨細(xì)胞肥大分化情況。利用western blots分析4周齡TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的肥大分化相關(guān)蛋白R(shí)unx2、sterix、Col2al、Col10al,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21KIP1、p27KIP1、 p57KIP2,以及終末肥大分化相關(guān)蛋白MMP13、OPN的表達(dá)。取E18.5的小鼠脛骨,行冰凍切片Von Kossa染色,觀察TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的終末肥大軟骨細(xì)胞的數(shù)量及成骨情況。6、雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)TSC1CKO小鼠的表型。于出生后第3周開始給予TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠灌服雷帕霉素,繪制其生存曲線,觀察雷帕霉素對(duì)TSC1CKO、鼠死亡率的影響。取12周齡TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠,行茜素紅-阿爾新藍(lán)染色,觀察小鼠的骨骼發(fā)育情況及骨化情況。對(duì)4周齡的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠給予2周雷帕霉素處理后,切片行HE染色觀察其脛骨生長(zhǎng)板增殖區(qū)及肥大區(qū)的變化。取TSC1CKO小鼠,TSC1flox/flox小鼠及雷帕霉素處理過后的TSC1CKO小鼠脛骨生長(zhǎng)板組織,利用Western blots分析雷帕霉素對(duì)細(xì)胞周期蛋白以及增殖蛋白例如PCNA、Cyclin D1,肥大分化相關(guān)蛋白及終末分化相關(guān)蛋白例如Col2al、Coll0al、Runx2、Osterix、MMP13、OPN的影響。7、TSC1CKO小鼠出現(xiàn)相關(guān)表型的機(jī)制研究。利用qPCR分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長(zhǎng)板的IHH, PTHrP、Gli1、Patched1的mRNA表達(dá)水平。利用western blots分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的生長(zhǎng)板組織,研究IHH-PTHrP軸中相關(guān)蛋白的變化情況。利用免疫組織化學(xué)分析PTHrP在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長(zhǎng)板的表達(dá)情況。利用免疫組織化學(xué)分析接受了雷帕霉素一周后,PTHrP在P14天的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長(zhǎng)板的表達(dá)情況。給予雷帕霉素處理過后,利用western blots檢測(cè)TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠脛骨生長(zhǎng)板組織的PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染Gli2質(zhì)粒或者Gli2突變體S234E或者siRNA后觀察PTHrP的變化情況,以及經(jīng)過雷帕霉素處理過后的情況。給予IGF-1模擬生理性mTORC1激活后,觀察雷帕霉素處理對(duì)軟骨細(xì)胞Patchedl、Gli1、PTHrP的影響。轉(zhuǎn)染核糖體S6激酶1(S6K1)過表達(dá)質(zhì)粒,利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)(luciferase assay)觀察S6K1對(duì)PTHrP及Patchedl表達(dá)的影響。給予培養(yǎng)的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox軟骨細(xì)胞Patchedl抑制劑GDC-0449及Gli1/2抑制劑GANT-61,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。給予培養(yǎng)的TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞GDC-0449及雷帕霉素,提取蛋白,檢測(cè)Gli1、PTHrP、 Patchedl蛋白的變化。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Gli2與PTHrP的相互作用在TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞的變化情況。8、mTORC1通路下游蛋白S6K1與Gli2相互作用的研究。利用免疫共沉淀方法,檢測(cè)S6K1和Gli2、Gli1的相互作用。利用免疫共沉淀辦法,檢測(cè)TSC1CKO及TSC1flox/flox小鼠中磷酸化Gli2即p-Gli2的情況,以及雷帕霉素對(duì)其的影響。提取TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠軟骨細(xì)胞以及經(jīng)過雷帕霉素處理的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)組分,Western Blots檢測(cè)Gli1、 Gli2、SuFu蛋白的核漿分布情況。轉(zhuǎn)染S6K1過表達(dá)質(zhì)粒至小鼠成軟骨細(xì)胞即ATDC5細(xì)胞給予雷帕霉素處理后,提取其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)組分,Western Blots檢測(cè)Gli1、Gli2、SuFu蛋白的核漿分布情況。給予ATDC5細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1因子)處理,模擬體內(nèi)生理刺激后,給予雷帕霉素處理,提取其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)組分,Western Blots檢測(cè)Gli1、Gli2、SuFu蛋白的核漿分布情況。利用免疫共沉淀,檢測(cè)TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)SuFu與Gli1、Gli2的相互作用情況。將Gli2質(zhì)粒、Gli2突變體激活型S234E質(zhì)粒以及Gli2突變體抑制型S234A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ATDC5細(xì)胞,利用免疫共沉淀,檢測(cè)以上處理對(duì)Gli2與SuFu相互作用的影響。將Gli2質(zhì)粒、Gli2突變體激活型S234E質(zhì)粒以及Gli2突變體抑制型S234A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ATDC5細(xì)胞,提取蛋白,使用Western blots檢測(cè)PTHrP、Gli1、Gli2蛋白表達(dá)情況。將S6K1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ATDC5細(xì)胞,提取蛋白,Western blots檢測(cè)PTHrP、Gli1、Gli2蛋白表達(dá)情況。將培養(yǎng)的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠軟骨細(xì)胞給予雷帕霉素處理,行免疫熒光,觀察PTHrP在其中的表達(dá)情況以及Gli2在其中的核漿分布情況。四、結(jié)果1、軟骨分化過程中mTORCl通路活性發(fā)生變化。通過E14.5天的小鼠肱骨切片免疫熒光染色,我們發(fā)現(xiàn)mTORC1通路活性標(biāo)志pS6蛋白在增殖區(qū)(PZ)及前肥大區(qū)(PHZ)表達(dá)最高,而在肥大區(qū)(HZ)基本缺失。同樣的現(xiàn)象,在出生后的小鼠即P7天、P18天的小鼠脛骨切片上得到證實(shí)。普通軟骨培養(yǎng)基以及ITS軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的原代軟骨細(xì)胞,ITS誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)原代軟骨向肥大軟骨細(xì)胞分化,隨著分化的進(jìn)行,其表達(dá)的TSC1逐漸增多,而pS6表達(dá)逐漸減少。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明隨著軟骨分化的進(jìn)行,增殖區(qū)及前肥大區(qū)軟骨細(xì)胞有高的mTORC1活性,而肥大區(qū)軟骨細(xì)胞mTORC1活性較低。qPCR也證實(shí)了ITS培養(yǎng)基的原代軟骨細(xì)胞肥大分化增多,出現(xiàn)終末肥大分化的標(biāo)志蛋白MMP13。同時(shí),免疫熒光染色也顯示了mTORC1活性的變化是由于分化過程中TSC1蛋白的變化所導(dǎo)致的。2、抑制mTORC1活性可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞終末分化10nnM濃度的雷帕霉素可以抑制軟骨細(xì)胞增殖。qPCR顯示雷帕霉素處理可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞退出增殖周期,進(jìn)入肥大分化及終末分化,表現(xiàn)為分化相關(guān)的IHH, Co110al的mRNA表達(dá)增高以及終末分化指標(biāo)的MMPl3的mRNA表達(dá)增高。HE切片分析顯示,給予雷帕霉素后,增殖區(qū)縮短。原位雜交顯示給予雷帕霉素后,小鼠脛骨生長(zhǎng)板的MMP13表達(dá)增多。Western blots也證實(shí)雷帕霉素處理后MMP13表達(dá)增多。3、軟骨細(xì)胞內(nèi)過度激活的mTORC1通路會(huì)導(dǎo)致小鼠軟骨發(fā)育不良。構(gòu)建出的TSC1CKO小鼠表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞內(nèi)TSC1表達(dá)缺失,pS6表達(dá)顯著增高。免疫熒光顯示,TSC1flox/flox小鼠肱骨高表達(dá)的pS6蛋白局限于增殖區(qū)PZ、前肥大區(qū)PHZ,肥大區(qū)HZ pS6蛋白缺失,靜息區(qū)RZ有較低的pS6活性；TSC1CKO小鼠肱骨的pS6蛋白在靜息區(qū)RZ、增殖區(qū)PZ、前肥大區(qū)PHZ、肥大區(qū)HZ都有高表達(dá)。結(jié)果顯示TSC1CKO小鼠的所有時(shí)期的軟骨細(xì)胞都有強(qiáng)的mTORC1活性。大體照片顯示TSC1CKO小鼠的體長(zhǎng)以及肱骨、脛骨、股骨長(zhǎng)度均小于TSC1flox/flox小鼠。HE切片分析顯示,出生P0天TSC1CKO小鼠的脛骨肥大區(qū)軟骨高度明顯短與同窩對(duì)照。出生2W后TSC1CKO小鼠肥大區(qū)高度和同窩對(duì)照基本一致,4W、8W、12W的TSC1CKO、鼠,其脛骨肥大區(qū)高度都明顯多于同窩對(duì)照小鼠。4、過度激活的mTORCl通路使TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞增殖增加。HE切片分析顯示,TSC1CKO小鼠的肋軟骨細(xì)胞中有更多的處在分裂相的軟骨細(xì)胞。BrdU免疫熒光顯示,TSC1CKO小鼠的脛骨靜息區(qū)、增殖區(qū)軟骨細(xì)胞中的BrdU陽性細(xì)胞都明顯多于TSC1flox/flox小鼠,同時(shí)在TSC1CKO小鼠的肥大期軟骨中,也發(fā)現(xiàn)有BrdU陽性細(xì)胞。結(jié)果說明TSC1CKO小鼠的軟骨細(xì)胞增殖增加,甚至在本應(yīng)退出細(xì)胞周期的肥大軟骨細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了增殖現(xiàn)象。Western blots顯示TSC1CKO軟骨細(xì)胞的PCNA、Cyclin D1、Cyclin B1表達(dá)增高。免疫組織化學(xué)顯示,Cyclin B1表達(dá)水平增高,在肥大期軟骨內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有Cyclin B1高表達(dá)。軟骨細(xì)胞的增殖曲線顯示,TSC1CKO的軟骨細(xì)胞增殖增加。5、過度激活的mTORC1通路抑制軟骨細(xì)胞的成熟分化。原位雜交顯示4周齡的TSC1CKO小鼠的Col10al的表達(dá)區(qū)域高度明顯高于同窩對(duì)照。Western blots結(jié)果顯示TSC1CKO小鼠的肥大分化相關(guān)基因Runx2、 Col10al、Osterix、p21KIP1、p27KIP1、p57KIP2均表達(dá)降低,而終末分化相關(guān)基因OPN、MMP13表達(dá)亦是降低。BrdU chase assay顯示,TSC1CKO小鼠的增殖期軟骨細(xì)胞向肥大分化速度變慢。免疫組化顯示TSC1CKO小鼠脛骨生長(zhǎng)板的p57KIP2表達(dá)水平較同窩對(duì)照低。冰凍切片的Von Kossa顯示TSC1CKO小鼠的終末肥大軟骨細(xì)胞減少。6、雷帕霉素可以抑制TSC1敲除小鼠的軟骨發(fā)育不良表型的發(fā)生。給予雷帕霉素灌胃后,TSC1CKO小鼠的死亡率減少。骨架染色顯示TSC1CKO小鼠的體型較小,肋軟骨不能骨化,給予雷帕霉素灌胃的TSC1CKO小鼠肋軟骨開始骨化。HE切片分析顯示,TSC1CKO小鼠的肥大期軟骨區(qū)高度較大,給予雷帕霉素后,TSC1CKO小鼠的肥大期軟骨區(qū)變窄。Western blots顯示,TSC1CKO小鼠細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA增加,而分化相關(guān)的蛋白Col10al、Runx2、MMP13、OPN表達(dá)均降低。7、mTORC1通路的活性是PTHrP的分泌過程所需要的。qPCR顯示,TSC1CKO小鼠軟骨組織IHH mRNA表達(dá)同對(duì)照組沒有差異,而PTHrP、Gli1、Patched1表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高。Western blots顯示Gli1、 PTHrP、Patchedl表達(dá)量增高明顯,而且雷帕霉素可以降低這些蛋白的表達(dá)。免疫組化顯示,TSC1CKO小鼠軟骨組織中PTHrP表達(dá)明顯升高,且給予雷帕霉素后,PTHrP表達(dá)降低。20nnM濃度的雷帕霉素能夠抑制TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)染Gli2、S234E質(zhì)粒以及給予雷帕霉素處理后,Western blots顯示Gli2及其激活型突變S234E可以增強(qiáng)PTHrP蛋白表達(dá)水平。給予IGF-1因子模擬生理性刺激顯示PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表達(dá)水平均明顯增加。Luciferase assay顯示過表達(dá)S6K1可以增加PTHrP及Patchedl的表達(dá),而給予雷帕霉素可以抑制S6K1的效應(yīng)；過表達(dá)S6K1+Gli2可以增加PTHrP表達(dá),而同時(shí)轉(zhuǎn)染Gli2siRNA可以抵消這種效應(yīng)。給予TSC1flox/flox小鼠軟骨細(xì)胞GDC-0449以及GANT-61,兩者均可抑制其增殖；而在TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞上,GDC-0449不能抑制其增殖。Western blots顯示相比GDC-0449,雷帕霉素仍可抑制Gli1、 PTHrP.Patchedl的表達(dá).CHIP實(shí)驗(yàn)證明,Gli2和PTHrP啟動(dòng)子的結(jié)合,TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞中增強(qiáng),而雷帕霉素可以抑制這種效應(yīng)。8、mTORC1/S6K1通路通過影響Gli2來調(diào)控PTHrP分泌。免疫共沉淀顯示,S6K1同Gli1及Gli2有相互作用,而這種作用在TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞中增強(qiáng),同時(shí)雷帕霉素可以抑制S6K1同Gli1及Gli2的結(jié)合。另一項(xiàng)免疫共沉淀顯示,磷酸化的Gli2在TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞中增多,而雷帕霉素可以抑制Gli2的磷酸化。Western blots顯示Gli1、Gli2在TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞中,更多比例的分布在細(xì)胞核,表明TSC1CKO小鼠的Gli1、Gli2入核增多,而雷帕霉素亦可以阻止其入核；轉(zhuǎn)染S6K1的ATDC5細(xì)胞以及給予IGF-1因子刺激的相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)此現(xiàn)象。同時(shí)我們看到,免疫共沉淀顯示SuFu與Gli1、Gli2的結(jié)合在TSC1CKO上減少,表明TSC1敲除影響了SuFu和Gli1、 Gli2的結(jié)合。轉(zhuǎn)染Gli2、S234A、S234E的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明,磷酸化位點(diǎn)的有無對(duì)于SuFu和Gli2的結(jié)合有影響。轉(zhuǎn)染Gli2、S234A、S234E質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)顯示,激活型S234E能夠增強(qiáng)PTHrP及Gli1表達(dá),而S234A可以一定程度上抑制PTHrP及Gii1表達(dá)。轉(zhuǎn)染S6K1過表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)證明PTHrP、Gli1的表達(dá)均上升。免疫熒光也證實(shí)TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞的PTHrP增多,而雷帕霉素可以抑制其表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也觀察到,TSC1CKO小鼠軟骨細(xì)胞的Gli2入核增多。五、結(jié)論本文利用基因敲除小鼠與細(xì)胞模型,探討了TSC1/mTORC1/S6K1信號(hào)通路在軟骨發(fā)生中的作用及PTHrP分泌調(diào)控機(jī)制,得出以下主要結(jié)論：1、軟骨細(xì)胞規(guī)律的增殖肥大分化過程中,伴隨著mTORC1通路活性的變化：靜息期軟骨細(xì)胞維持一定的mTORCl活性,增殖期及前肥大期軟骨細(xì)胞mTORC1活性增高,隨后分化進(jìn)行時(shí)肥大期軟骨細(xì)胞mTORC1活性缺失。2、mTORC1抑制劑雷帕霉素可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大分化,特別是終末肥大分化。3、軟骨細(xì)胞內(nèi)過度激活的mTORC1使得小鼠出現(xiàn)侏儒表型。主要原因是,軟骨細(xì)胞增殖增加,肥大分化減少,終末肥大分化延遲,成骨延遲。而雷帕霉素可以一定程度上逆轉(zhuǎn)這個(gè)現(xiàn)象。4、過度激活的mTORC1通路主要通過調(diào)控PTHrP來影響軟骨細(xì)胞規(guī)律分化。激活的mTORC1導(dǎo)致PTHrP表達(dá)增多。增多的PTHrP使得肥大分化變慢,終末肥大分化及成骨延遲。5、過度激活的mTORC1通路是通過S6K1和Gli2的相互作用使PTHrP表達(dá)增多。S6K1使Gli2的S234位點(diǎn)磷酸化增多,抑制SuFu同Gli2的結(jié)合,從而使得Gli2入核增多,使得PTHrP表達(dá)增多。至此,本研究不僅證明mTORC1通路活性是伴隨軟骨細(xì)胞增殖分化而變化的,而且證明了適當(dāng)?shù)摹⒕_調(diào)控的mTORC1通路活性對(duì)于軟骨細(xì)胞正常的增殖分化來說是至關(guān)重要的。而且我們闡明了mTORC1是如何調(diào)控PTHrP分泌來控制軟骨細(xì)胞的規(guī)律分化這一新機(jī)制。本研究為了解軟骨細(xì)胞發(fā)育分化提供新的觀點(diǎn),為臨床上各類軟骨發(fā)育不良及各類侏儒癥的診治提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R336

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