【摘要】：蛋白酶是一類催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的重要工業(yè)用酶,廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中,在生物體中執(zhí)行著不同的生理功能。本論文系統(tǒng)研究了三種不同來(lái)源(植物、細(xì)菌和真菌)蛋白酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究,論文得出的主要結(jié)論如下：測(cè)定了90種植物樣品提取液的蛋白酶活性,其中10種水果和14種蔬菜的蛋白酶活力在10 U/g以上。除菠蘿、無(wú)花果和木瓜等商品化蛋白酶來(lái)源樣品具有高活性外,獼猴桃、西蘭花、姜、韭菜和尖椒在不同pH條件下也表現(xiàn)出高酶活力。結(jié)合SDS-PAGE、酶譜、蛋白酶類型及肽段分析,這5種植物樣品具有新型蛋白酶的開(kāi)發(fā)潛力。選取活力最高的獼猴桃為研究對(duì)象,分析7個(gè)品種獼猴桃樣品粗酶液的蛋白酶、凝乳酶活性和蛋白分布情況,采用徐香獼猴桃開(kāi)展進(jìn)一步的研究。獼猴桃粗酶液經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和QSFF強(qiáng)陰離子交換層析兩步純化得到了電泳級(jí)純酶(Actinidin)。純酶最適pH和溫度分別為3.5和40℃,在pH 3.5-6.0和40℃以下保持穩(wěn)定。碘乙酰胺對(duì)酶活性的強(qiáng)烈抑制作用表明該酶為半胱氨酸蛋白酶。較低濃度的Actinidin(0.25 mg/100 g肉重)對(duì)兔肉具有良好的嫩化效果。Actinidin水解5種植物蛋白后,產(chǎn)物的多肽得率最高達(dá)14.2%,ACE抑制率最高達(dá)88.3%,具有開(kāi)發(fā)ACE抑制肽的潛力。從醬油曲樣品中篩選得到一株產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌CAU342A,經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化后其液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最適條件為(g/L)：酒糟30,酵母提取物15,吐溫-800.5,NaCl 5,K2HPO47, KH2PO43, MnSO40.4,培養(yǎng)基初始pH 7.5,培養(yǎng)溫度30℃,發(fā)酵3 d,最高酶活力為2653.5 U/mL。粗酶液經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化得到了電泳級(jí)純酶(PaproA),比酶活力為8477.4 U/mg,回收率為9.8%。SDS-PAGE測(cè)定純酶分子量為32.2 kDa,凝膠過(guò)濾層析測(cè)定其分子量為34.5 kDa,該酶為單亞基蛋白。純酶最適pH和最適溫度分別為9.0和55℃,在pH 7.0-9.5和60℃以下保持穩(wěn)定。EDTA對(duì)蛋白酶活力具有強(qiáng)烈抑制作用,表明該酶為金屬蛋白酶。蛋白酶PaproA其有較廣泛的底物特異性,對(duì)酪蛋白、脫脂乳和魚精蛋白水解能力較強(qiáng),不能水解明膠和膠原蛋白。蛋白酶PaproA在ACE抑制肽和配制醬油的制備中具有應(yīng)用潛力。成功將米黑根毛霉CAU432中的蛋白酶基因(RmproA)克隆、表達(dá)至畢赤酵母中。該基因?qū)儆陔拿?Peptidase A1)家族的天冬氨酸蛋白酶,開(kāi)放閱讀框(ORF)為1326 bp,編碼442個(gè)氨基酸并不含內(nèi)含子。重組蛋白酶(RmproA)經(jīng)5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后酶活力為3480.4U/mL。粗酶液經(jīng)QSFF強(qiáng)陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化得到電泳級(jí)純酶(RmproA),比酶活力為773.3 U/mg。RmproA為單亞基蛋白,SDS-PAGE顯示其分子量為52.4 kDa并發(fā)生糖基化作用。RmproA的最適pH和最適溫度分別為5.5和55℃,在pH 5.0-8.0范圍內(nèi)及50℃以下保持穩(wěn)定。天冬氨酸蛋白酶抑制劑Pepstatin A對(duì)酶活力有顯著抑制作用。RmproA對(duì)酪蛋白、脫脂乳、偶氮酪蛋白和大豆分離蛋白有較好的水解能力,不能水解魚精蛋白和膠原蛋白。經(jīng)RmproA處理的豬肉具有較小的剪切力,表明其在肉類嫩化中具有一定的應(yīng)用潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q814

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本文編號(hào)：2373318