【摘要】：開(kāi)花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的開(kāi)關(guān),是植物生命周期重要組成部分。植物成花調(diào)控研究主要集中在一年生模式植物擬南芥中,多年生植物成花誘導(dǎo)是更為復(fù)雜的遺傳調(diào)控過(guò)程,其調(diào)控開(kāi)花的分子機(jī)制仍不清楚。鑒于草本植物與木本植物在發(fā)育過(guò)程中存在巨大差異,延長(zhǎng)林木童期使其延緩進(jìn)入生殖期對(duì)林木資源開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義。為了探究白樺晚花調(diào)控機(jī)理,利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)兩個(gè)白樺成花調(diào)控抑制因子BpFLC和BpSVP基因的表達(dá)模式與功能進(jìn)行初步研究。主要結(jié)果如下：(1)白樺不同組織定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明BpFLC基因在各個(gè)組織中均有表達(dá),且在莖尖和幼葉中表達(dá)量最高。經(jīng)春化處理幼葉中BpFLC基因表達(dá)量顯著下調(diào)�？寺pFLC基因上游2000 bp啟動(dòng)子在植物表達(dá)載體中驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)并對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。GUS染色結(jié)果表明GUS主要在生長(zhǎng)點(diǎn)、幼葉、成熟花序中著色較深,幾乎所有組織中均有BpFLC基因表達(dá)。BpFLC啟動(dòng)子并不是春化應(yīng)答主要部位,大量證據(jù)表明FLC基因第一內(nèi)含子是響應(yīng)春化作用關(guān)鍵部位。(2)擬南芥flc突變體具有早花形態(tài)學(xué)特征,異源表達(dá)BpFLC基因能恢復(fù)flc突變體表型,回補(bǔ)植株呈現(xiàn)出正常開(kāi)花或晚花表型。BpFLC基因異源表達(dá)在野生型擬南芥中能顯著延遲開(kāi)花,并且轉(zhuǎn)基因植株能形成更多蓮座葉,更大的生殖器官并能延長(zhǎng)生命周期。異源表達(dá)BpFLC基因不能響應(yīng)春化作用。(3)利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)野生型和過(guò)表達(dá)BpFLC植株進(jìn)行測(cè)序分析,no-flowering組中有237個(gè)差異表達(dá)基因,其中51個(gè)基因上調(diào)表達(dá),186個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；flowering組中有852個(gè)差異表達(dá)基因,其中271個(gè)基因上調(diào)表達(dá),581個(gè)基因下調(diào)表達(dá),兩組重疊基因?yàn)?40個(gè)。GO富集顯示差異基因主要分布在生物過(guò)程調(diào)控、發(fā)育進(jìn)程、生殖過(guò)程、細(xì)胞成分的生物合成等功能組中,且存在大量與生殖發(fā)育相關(guān)基因,如花粉外壁形成、花粉細(xì)胞壁組裝、授粉作用、有性繁殖、生殖細(xì)胞進(jìn)程、花粉管發(fā)育和花粉管生長(zhǎng)。(4)從白樺幼葉中克隆出晚花調(diào)控基因BpSVP,其開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為678 bp,共編碼氨基酸225個(gè),其屬于MIKC型MADS蛋白家族,蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為25.25KD,理論等電點(diǎn)為6.68,同源性分析顯示與山核桃的同源性最高(92%)。(5)白樺不同組織定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明BpSVP基因僅在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá),且在幼齡植株內(nèi)的表達(dá)量要高于成齡植株,同時(shí)幼葉中的表達(dá)量也高于成熟葉和莖尖。BpSVP基因響應(yīng)光周期調(diào)控而不應(yīng)答春化調(diào)控。構(gòu)建BpSVP-GFP融合載體pUC-35S::BpSVP-GFP,并瞬時(shí)轟擊洋蔥表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位表明,BpSVP是一個(gè)核定位蛋白。克隆BpSVP基因上游啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-BpSVPpro,驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)并對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。GUS染色結(jié)果表明GUS主要在根、幼苗、蓮座葉及萼片中均有著色,推測(cè)BpSVP基因在植物生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。(6)構(gòu)建植物表達(dá)載體pROKII-BpSVP并轉(zhuǎn)化擬南芥,BpSVP在轉(zhuǎn)基因植株的基因組與轉(zhuǎn)錄組水平中均能檢測(cè)到。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出晚花表型,約推遲開(kāi)花20天,同時(shí)轉(zhuǎn)基因株系存在畸形花。定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源AtFLC表達(dá)水平顯著上調(diào),AtSOC1、AtFD、AtFT、AtLFY、AtAP1等成花基因的表達(dá)水平顯著下調(diào),而AtSVP與AtAGL24表達(dá)水平變化不顯著。(7)酵母雙雜交驗(yàn)證結(jié)果顯示BpFLC能與BpSVP發(fā)生蛋白互作,進(jìn)一步驗(yàn)證顯示BpFLC與BpSVP也分別能與自身及自身截短體發(fā)生同源相互作用。BpFLC與BpSVP截短體之間的異源互作驗(yàn)證證明,BpFLC3和BpSVP3中的K結(jié)構(gòu)域是BpFLC與BpSVP發(fā)生同源或異源互作的基礎(chǔ)。最后,酵母雙雜交顯示BpFLC也能與AtFLC及AtSVP發(fā)生蛋白互作。綜上所述,本研究將為多年生林木調(diào)控開(kāi)花提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為林木遺傳改良提供理論依據(jù)和相關(guān)基因。
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【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S792.153;Q943.2
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本文編號(hào)：2285293