【摘要】：普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)屬淀粉脫支酶,為淀粉加工業(yè)中的非大宗關(guān)鍵酶制劑,目前具有工業(yè)屬性的普魯蘭酶非常有限,價格昂貴,且存在熱穩(wěn)定性及pH耐受性差等缺陷,提高普魯蘭酶的回收利用率及穩(wěn)定性是該酶研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。論文擬采用固定化技術(shù)改善普魯蘭酶的酶學(xué)特性,實(shí)現(xiàn)其重復(fù)利用。磁性納米材料用于固定化酶具有諸多優(yōu)勢,如較大的比表面積、較小的傳質(zhì)阻力、超順磁性及良好的生物相容性等。因此,本課題從靜電吸附、共價交聯(lián)、化學(xué)結(jié)合包埋等方法出發(fā),采用有機(jī)凝膠誘導(dǎo)及原位共沉淀等方法制備新型的磁性納米復(fù)合物應(yīng)用于普魯蘭酶的固定,得到催化效率高、穩(wěn)定性好、易于分離的固定化酶,并將其成功應(yīng)用于抗性淀粉的制備中。首先,采用原位共沉淀法制備磁性卡拉膠納米復(fù)合物,通過靜電吸附殼聚糖-普魯蘭酶復(fù)合物得到固定化酶。采用TEM、XRD、FTIR、VSM及TGA等手段對固定化酶進(jìn)行表征,結(jié)果表明固定化酶的平均粒徑為152 nm,具有Fe3O4尖晶石結(jié)構(gòu);卡拉膠硫酸基團(tuán)電荷被中和后固定化酶磁響應(yīng)性提高到42.6 emu/g。在最佳固定條件下,所得到的固定化酶的酶活保留率達(dá)到95.6%,酶固載量為96.4 mg/g;重復(fù)使用10次后仍能保留原始酶活的61%,顯著的改善了催化反應(yīng)過程中酶泄漏現(xiàn)象。研究了靜電吸附固定過程中殼聚糖分子量對普魯蘭酶-殼聚糖可溶性復(fù)合物的形成以及固定效果的影響。通過濁度滴定法研究普魯蘭酶與殼聚糖的復(fù)合行為,結(jié)果表明pHφ1、pHmax的出現(xiàn)及偏移均受殼聚糖分子量的影響,其中,普魯蘭酶-殼聚糖-50的pHφ1偏移到更低pH值以達(dá)到電中和。復(fù)合物表面電荷隨著殼聚糖分子量的增大而增多,平均粒度逐漸降低。采用熒光光譜研究殼聚糖對普魯蘭酶的熒光淬滅作用,結(jié)果表明殼聚糖與普魯蘭酶的結(jié)合常數(shù)(Ksv)按CS-500CS-400CS-50CS-200順序增大。通過對酶二級結(jié)構(gòu)變化的研究表明殼聚糖-200-普魯蘭酶復(fù)合物中酶的二級結(jié)構(gòu)變化較大,α-helix從31%降低到19%,影響到固定化酶的最終酶活:當(dāng)殼聚糖分子量為200 kDa時,酶活保留率較低(46.1%),且操作穩(wěn)定性較差,而當(dāng)殼聚糖分子量為50 kDa時,固定化酶酶活保留率達(dá)到最大值(96.3%),并且展示了較好的熱穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。其次,采用殼聚糖水凝膠誘導(dǎo)法原位制備Fe3O4-殼聚糖納米粒子并共價固定普魯蘭酶。采用TEM、FT-IR、XRD及TGA等手段表征Fe3O4-殼聚糖納米粒子,結(jié)果表明有機(jī)誘導(dǎo)合成Fe3O4-殼聚糖納米粒子過程中螯合作用限制了鐵離子擴(kuò)散和晶體生長,所得到的納米顆粒平均粒徑為5 nm,飽和磁強(qiáng)度為60.8 emu/g,殼聚糖及Fe3O4的含量分別為12.7%和83.28%。通過研究共價固定過程中酶初始濃度及pH值的影響發(fā)現(xiàn),最佳的固定條件為:酶濃度60μg/m L,pH值4.4;酶固定后熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性相較于自由酶大幅提高,其最適pH值往酸性方向偏移(pH 3.5)�；诠矁r交聯(lián)固定,探討了不同的共價固定方式(EDC或GA交聯(lián)、NaBH4還原)、共價固定密度及交聯(lián)劑臂長對固定化效果的影響。研究表明,GA為交聯(lián)劑時固定化酶酶活保留率高于EDC為交聯(lián)劑得到的固定化酶;由于GA活化的載體用于固定化酶時基于與酶賴氨酸氨基的反應(yīng),因此進(jìn)一步用NaBH4還原席夫堿為更穩(wěn)定的仲氨鍵得到了操作穩(wěn)定性較高的固定化酶,然而,還原作用有可能還原酶的部分二硫鍵,使得固定化酶的活性降低;當(dāng)載體表面氨基濃度為1.6 per nm2時,固定化酶的酶活保留率達(dá)到最大值(75%),此時,酶與載體間形成大約57.6 per 3600??2共價鍵;GA活化時較長的手臂(15%,二聚體)相比較短的手臂(0.5%,單體)擁有更高的酶活保留率(85%)。然后,基于Fe3O4-殼聚糖納米粒子,在共價固定的基礎(chǔ)上,采用sol-gel法設(shè)計合成了磁性殼聚糖納米顆粒為內(nèi)核、聚合物為外殼的包埋固定化普魯蘭酶。采用SEM、VSM、FTIR及TGA等手段對固定化酶進(jìn)行表征,結(jié)果表明在sol-gel反應(yīng)過程中,添加酶后所得到的凝膠顆粒形貌更規(guī)整,磁響應(yīng)性也提高到26.8 emu/g,普魯蘭酶的含量約為8.83%。包埋固定的最佳條件為:硅烷前體的種類及比例為OTES/TEOS=1/2,酶濃度0.484mg/m L sol。比較共價結(jié)合與非共價結(jié)合包埋酶的酶學(xué)性質(zhì)差異,結(jié)果表明共價結(jié)合包埋所得到的固定化酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性顯著高于單一包埋所得到的固定化酶,酶泄露現(xiàn)象得到改善;從穩(wěn)定性及酶活保留率兩方面綜合考慮,將酶首先通過碳二亞胺活化與磁性載體交聯(lián)后再sol-gel包埋得到的固定化酶的效果較好,其酶活保留率為81.3%,重復(fù)使用6次后相對酶活仍為原始酶活的87%。最后,將上述三種固定方法制備得到的固定化酶用于抗性淀粉的制備,研究結(jié)果表明,采用壓熱聯(lián)合自由酶水解得到的抗性淀粉含量(35.1%)高于僅采用壓熱處理(12.5%),而采用壓熱聯(lián)合固定化酶水解得到的抗性淀粉含量高于自由酶處理,其中包埋固定化酶處理最高,達(dá)到43.3%。采用HPSEC測定酶水解后淀粉分子量變化,結(jié)果表明,與自由酶相比,共價及包埋固定化酶處理的淀粉樣品出現(xiàn)Peak C特征峰(對應(yīng)于分子量6200),傾向于產(chǎn)生更多的低分子量線性短側(cè)鏈。通過DSC測定不同淀粉樣品的糊化溫度,結(jié)果表明酶脫支處理后淀粉的峰值溫度都往更高的方向偏移(130℃左右)。重復(fù)使用性結(jié)果表明,靜電吸附、共價交聯(lián)以及共價結(jié)合包埋得到的固定化酶在重復(fù)水解淀粉樣品8次后,其抗性淀粉得率分別為原始的61.3%、70.4%及75.7%。綜合抗性淀粉得率及酶的重復(fù)使用性考慮,共價結(jié)合包埋得到的固定化酶在抗性淀粉制備方面相較于其它兩種固定方法效果更好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q814.2;TB33

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本文編號：2270345