重組大腸桿菌生產(chǎn)核黃素和β-胡蘿卜素的途徑構(gòu)建與改造
發(fā)布時(shí)間：2021-06-30 11:04
本研究通過(guò)核黃素合成途徑的構(gòu)建,中心碳代謝的改造及發(fā)酵條件的優(yōu)化的策略,研究了大腸桿菌生產(chǎn)核黃素的代謝能力;其次,利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù),在大腸桿菌的基因組上整合β-胡蘿卜素合成基因,對(duì)MEP途徑、中心碳代謝途徑進(jìn)行組合改造,獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌。首先,考察大腸桿菌自身核黃素合成基因在不同拷貝數(shù)質(zhì)粒中表達(dá)對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響,并與枯草芽孢桿菌核黃素合成基因比較。通過(guò)發(fā)酵驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌自身核黃素合成基因在高拷貝質(zhì)粒過(guò)表達(dá)更有利于核黃素的積累。5-磷酸核酮糖是核黃素合成的重要前體物。為了提高5-磷酸核酮糖的供給,本文對(duì)氧化磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑以及ED途徑(Entner-Doudoroff Pathway)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)來(lái)源于谷氨酸棒桿菌的突變型zwf243和gnd361基因不能有效的提高核黃素產(chǎn)量;進(jìn)一步過(guò)表達(dá)大腸桿菌Qg源pgl基因能夠進(jìn)一步提高核黃素的產(chǎn)量;敲除糖酵解途徑中pgi基因構(gòu)建RF02S,使得核黃素的產(chǎn)量提高了72.4%,進(jìn)一步失活ED途徑使得核黃素的產(chǎn)量提高41.8%;過(guò)表達(dá)acs基因能夠有效的降低副產(chǎn)物乙酸的積累,對(duì)核黃素的產(chǎn)量沒(méi)有明顯的影響。最終獲得工程菌RF05S在以10g/L葡萄糖為底物的LB培養(yǎng)基中能夠積累585.2±13.6mg/L核黃素。為了防止過(guò)多的核黃素轉(zhuǎn)化為FMN和FAD,在不影響菌體生長(zhǎng)的情況下提高核黃素的產(chǎn)量,通過(guò)對(duì)催化該反應(yīng)的酶基因ribF的RBS強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)。獲得工程菌RF05S-M40的核黃素激酶活性是出發(fā)菌株的64.8%,核黃素的產(chǎn)量達(dá)到1019.6±25.3mg/L�？疾霷F05S-M40在不同的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基,RF05S-M40能夠積累2702.8±89.9 mg/L得率137.5 mg/g glucose,是迄今為止報(bào)道的核黃素得率最高工程菌株。本文第二部分利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù),將β-胡蘿卜素合成基因整合到基因組上,對(duì)MEP途徑進(jìn)行組合調(diào)控以增強(qiáng)IPP和DMAPP的合成,獲得工程菌ZF43能夠積累21.45±0.46mg/Lβ-胡蘿卜素。G3P和Pyr是MEP途徑的直接前體物,NADPH是β-胡蘿卜素合成的重要輔因子。為了提高這些代謝物的供給,對(duì)中心碳代謝、MEP途徑及β-胡蘿卜素合成途徑進(jìn)行組合優(yōu)化,獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌ZF237T,高密度發(fā)酵能夠獲得2.02g/Lβ-胡蘿卜素。首次在大腸桿菌中將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的應(yīng)用于代謝工程改造,并獲得高產(chǎn)菌種。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;Q936
本文編號(hào)：2204290
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;Q936
文章目錄
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
1.1 引言
1.2 核黃素的概述
1.2.1 核黃素的理化性質(zhì)、功能、用途及市場(chǎng)需求
1.2.2 核黃素的合成
1.2.3 核黃素生物合成途徑及其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制
1.2.4 產(chǎn)核黃素菌株構(gòu)建的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀
1.3 β-胡蘿卜素的概述
1.3.1 β-胡蘿卜素的理化性質(zhì)、功能和用途
1.3.2 β-胡蘿卜素合成途徑
1.3.3 E.coli β-胡蘿卜素生物合成研究進(jìn)展
1.4 大腸桿菌基因組無(wú)痕重組技術(shù)及策略
1.4.1 λ-Red重組系統(tǒng)
1.4.2 歸巢核酸內(nèi)切酶
1.4.3 成簇間隔短回文重復(fù)(CRISPR)編輯系統(tǒng)
1.5 選題背景及研究?jī)?nèi)容
1.5.1 大腸桿菌核黃素產(chǎn)核黃素菌株的構(gòu)建
1.5.2 大腸桿菌產(chǎn)β-胡蘿卜素的構(gòu)建
第二章 核黃素操縱子的構(gòu)建和比較
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 菌株與質(zhì)粒
2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
2.1.4 培養(yǎng)基
2.1.5 溶液
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 大腸桿菌CaCl_2轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
2.2.2 大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化
2.2.3 基因組DNA的提取
2.2.4 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
2.2.5 DNA片段的PCR擴(kuò)增
2.2.6 瓊脂糖凝膠電泳
2.2.7 DNA片段的回收和純化
2.2.8 DNA片段的酶切和連接
2.2.9 菌落PCR驗(yàn)證
2.2.10 菌體培養(yǎng)與發(fā)酵
2.2.11 發(fā)酵液菌體濃度和葡萄糖的測(cè)定
2.2.12 發(fā)酵液中核黃素的測(cè)定
2.2.13 蛋白濃度測(cè)定
2.2.14 細(xì)胞粗酶液的制備
2.2.15 GTP環(huán)水解酶Ⅱ酶活力測(cè)定
2.2.16 核黃素合成酶酶活力測(cè)定
2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
2.3.1 大腸桿菌自身核黃素合成途徑的重構(gòu)
2.3.2 枯草芽孢桿菌核黃素操縱子的克隆
2.3.3 枯草芽孢桿菌核黃素操縱子的重構(gòu)
2.3.4 系列工程菌株核黃素產(chǎn)量表征
2.3.5 GTP環(huán)水解酶Ⅱ酶和核黃素合成酶活力測(cè)定
2.4 本章小結(jié)
第三章 產(chǎn)核黃素大腸桿菌中心碳代謝途徑的代謝工程改造
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
3.1.1 菌種和質(zhì)粒
3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
3.1.4 培養(yǎng)基
3.1.5 溶液
3.2 實(shí)驗(yàn)方法
3.2.1 Circular polymerase extension cloning
3.2.2 6-磷酸葡萄糖脫氫酶酶活力測(cè)定
3.2.3 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶酶活力測(cè)定
3.2.4 Real-Time熒光定量PCR
3.2.5 發(fā)酵液中有機(jī)酸的檢測(cè)
3.2.6 大腸桿菌基于λ-red和Ⅰ-SceⅠ的基因重組
3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
3.3.1 谷氨酸棒狀桿菌突變型zwf~(243)和gnd~(361)基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
3.3.2 氧化磷酸戊糖途徑過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
3.3.3 pgi基因敲除菌株的構(gòu)建
3.3.4 ED途徑敲除菌株的構(gòu)建
3.3.5 acs基因過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建
3.3.6 氧化磷酸戊糖途徑的改造對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響
3.3.7 pgi基因和ED途徑的敲除對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響
3.3.8 acs基因的過(guò)表達(dá)對(duì)乙酸積累的影響
3.4 本章小結(jié)
第四章 ribF基因的改造及發(fā)酵條件的優(yōu)化
4.1 實(shí)驗(yàn)材料
4.1.1 菌種和質(zhì)粒
4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
4.1.4 培養(yǎng)基
4.1.5 溶液
4.2 實(shí)驗(yàn)方法
4.2.1 核黃素激酶酶活力測(cè)定
4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
4.3.1 ribF基因的改造
4.3.2 置換ribF基因野生RBS片段的構(gòu)建
4.3.3 ribF基因野生RBS的置換
4.3.4 ribF基因的改造對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響
4.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化
4.4 本章小結(jié)
第五章 基于MEP途徑的產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌構(gòu)建
5.1 實(shí)驗(yàn)材料
5.1.1 菌種和質(zhì)粒
5.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
5.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
5.1.4 培養(yǎng)基
5.1.5 溶液
5.2 實(shí)驗(yàn)方法
5.2.1 β-胡蘿卜素的檢測(cè)方法
5.2.2 β-胡蘿卜素的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
5.2.3 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)λ-red重組
5.2.4 Golded Gate組裝方法
5.2.5 gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
5.3.1 整合β-胡蘿卜素合成基因到大腸桿菌EcKan染色體上
5.3.2 MEP途徑調(diào)控元件的片段構(gòu)建
5.3.3 考察MEP途徑單基因調(diào)控對(duì)β-胡蘿卜素合成的影響
5.3.4 MEP途徑的組合優(yōu)化
5.4 本章小結(jié)
第六章 中心碳代謝及MEP途徑的組合優(yōu)化對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
6.1 實(shí)驗(yàn)材料
6.1.1 菌種和質(zhì)粒
6.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
6.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
6.1.4 培養(yǎng)基
6.1.5 溶液
6.2 實(shí)驗(yàn)方法
6.2.1 高密度發(fā)酵重組大腸桿菌ZF237T
6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
6.3.1 中心碳代謝途徑操作片段的構(gòu)建
6.3.2 考察中心碳代謝單基因調(diào)控對(duì)β-胡蘿卜素合成的影響
6.3.3 中心碳代謝組合操作對(duì)β-胡蘿卜素合成的影響
6.3.4 β-胡蘿卜素合成途徑及MEP途徑的組合操作
6.3.5 中心碳代謝及MEP途徑的組合優(yōu)化
6.3.6 高密度發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素重組大腸桿菌ZF237T
6.4 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
7.1 結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
7.1.1 主要結(jié)論
7.1.2 創(chuàng)新點(diǎn)
7.2 展望
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文及參加科研情況說(shuō)明
附錄
致謝
【參考文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前9條
1 于慧敏;馬玉超;;工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年09期
2 段云霞;陳濤;陳洵;王靖宇;趙學(xué)明;;在枯草芽孢桿菌中表達(dá)B.cereus ATCC14579的異源核黃素操縱子提高核黃素產(chǎn)量(英文)[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2010年01期
3 李為全;陳海軍;陳長(zhǎng)華;李友元;;糖代謝關(guān)鍵酶活性對(duì)林可霉生物合成影響的研究[J];藥物生物技術(shù);2007年06期
4 陳濤;董文明;李曉靜;武秋立;陳洵;趙學(xué)明;;核黃素基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵的初步研究[J];高�；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào);2007年02期
5 陳濤,陳洵,王靖宇,趙學(xué)明;Effect of Riboflavin Operon Dosage on Riboflavin Productivity in Bacillus Subtilis[J];Transactions of Tianjin University;2005年01期
6 高建峰;β-胡蘿卜素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其生物合成[J];糧食與飼料工業(yè);2001年01期
7 施躍峰;天然β-胡蘿卜素研究開(kāi)發(fā)動(dòng)態(tài)[J];食品研究與開(kāi)發(fā);2000年02期
8 鮑曉明,高東,王祖農(nóng);木糖代謝工程菌的研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);1998年04期
9 詹豪強(qiáng);β─胡蘿卜素的工業(yè)合成[J];化工生產(chǎn)與技術(shù);1997年02期
相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條
1 王智文;產(chǎn)核黃素Bacillus subtilis中心代謝途徑代謝工程和比較基因組學(xué)[D];天津大學(xué);2011年
2 朱英波;產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌中心碳代謝的代謝工程[D];天津大學(xué);2007年
3 李曉靜;枯草芽孢桿菌核黃素操縱子及呼吸鏈的代謝工程改造[D];天津大學(xué);2006年
4 陳濤;基于基因組重排的產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的代謝工程[D];天津大學(xué);2004年
本文編號(hào)：2204290
本文鏈接：http://sikaile.net/shoufeilunwen/jckxbs/2204290.html
最近更新
教材專著
