本文關(guān)鍵詞：A549細(xì)胞對外源金屬離子刺激響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學(xué)》 2015年

鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC39A5在食管癌組織中的表達(dá)以及在食管癌細(xì)胞KYSE170中的作用及機(jī)制研究

吳巖  

【摘要】：目的:食管癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率為6.5/10萬,居所有惡性腫瘤第八位;死亡率為5.7/10萬,居所有腫瘤的第六位,嚴(yán)重威脅著人類健康。食管癌的發(fā)病與多種環(huán)境因素相關(guān),包括遺傳因素、食管局部損傷、嗜煙酒、亞硝胺類食物、霉菌及病毒感染、維生素及微量元素缺乏等,但其確切病因研究尚未取得突破性進(jìn)展。伴隨著分子生物學(xué)和高新生物技術(shù)的發(fā)展,對食管癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究及相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記物的探索已成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。ZIP5是鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC39A(ZIP)家族即溶質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族的一員,與鋅的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密切,食管癌組織的全基因表達(dá)譜芯片篩查發(fā)現(xiàn)包括ZIP5在內(nèi)的19種基因異常表達(dá),提示ZIP5在食管癌發(fā)生中可能具有重要作用,但具體作用機(jī)制尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過比較ZIP5在食管癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)差異,以及與COX-2表達(dá)的相關(guān)性,探討ZIP5與食管癌發(fā)展的作用和機(jī)制。在已建立的穩(wěn)定沉默ZIP5基因食管癌細(xì)胞系KYSE170的基礎(chǔ)上,在細(xì)胞水平觀察沉默ZIP5基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖、侵襲的影響并對ZIP5作用于食管癌細(xì)胞的分子機(jī)制進(jìn)行探討,為食管癌的預(yù)防以及靶向性治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法:1收集手術(shù)切除食管癌患者的食管癌組織、癌旁組織、正常組織58例。利用免疫組化方法比較ZIP5和COX-2蛋白在食管癌組織、癌旁組織與正常組織中的表達(dá)差異,統(tǒng)計(jì)分析其與臨床病理特征的關(guān)系以及二者的相關(guān)性。2培養(yǎng)穩(wěn)定沉默ZIP5基因食管癌細(xì)胞系KYSE170K及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞系KYSE170S,用MTT和CCK-8法繪制兩組細(xì)胞系的生長曲線,并檢測細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖情況;Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲情況;用PCR和Western Blot法驗(yàn)證ZIP5的沉默效果,并檢測與腫瘤相關(guān)基因COX-2、Cyclin D1及E-cadherin等在兩組細(xì)胞中的m RNA及蛋白水平的表達(dá)差異,探討ZIP5作用于食管癌細(xì)胞的分子機(jī)制。結(jié)果:1免疫組化結(jié)果顯示:在58例食管癌患者的癌組織、癌旁組織和正常組織中,ZIP5基因陽性表達(dá)例數(shù)分別為53例,30例和6例,ZIP5在癌組織、癌旁組織和正常組織的表達(dá)量分別為:4.64±3.67,1.14±1.29和0.19±0.66;在58例食管癌患者的癌組織、癌旁組織和正常組織中,COX-2基因陽性表達(dá)例數(shù)分別為36例,28例和1例,COX-2在癌組織、癌旁組織和正常組織的表達(dá)量分別為:2.09±2.23,1.14±1.57和0.02±0.13。ZIP5和COX-2在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁和正常組織,并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,浸潤深度和分化程度相關(guān),ZIP5和COX-2在食管癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。2 MTT結(jié)果顯示:細(xì)胞生長12h、24h、48h和72h后,空載體組KYSE170S的OD值分別為0.206±0.034,0.417±0.076,0.64±0.045和1.130±0.053;穩(wěn)定沉默ZIP5組KYSE170K的OD值分別為0.120±0.052,0.185±0.048,0.291±0.060和0.512±0.071,沉默ZIP5組較空載體組細(xì)胞生長明顯減慢(P0.05)。3 CCK-8結(jié)果顯示:細(xì)胞生長12h、24h、48h和72h后,空載體組KYSE170S的OD值分別為0.477±0.085,1.043±0.092,1.143±0.115和1.343±0.087;穩(wěn)定沉默ZIP5組KYSE170K的OD值分別為0.239±0.051,0.492±0.083,0.581±0.054和0.777±0.059,沉默ZIP5組較空載體組細(xì)胞生長明顯減慢(P0.05)。4 Transwell結(jié)果顯示:細(xì)胞生長24h后,未加入基質(zhì)膠的小室,空載體組穿過細(xì)胞數(shù)量約為3500±206.23,沉默ZIP5組穿過細(xì)胞數(shù)約為1500±127.68,加入基質(zhì)膠的小室,空載體組穿過細(xì)胞數(shù)量約為1200±106.49,沉默ZIP5組穿過細(xì)胞數(shù)約為500±78.74,沉默ZIP5明顯降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力57.2%和58.4%。5 Real-time PCR結(jié)果顯示:COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在空載體組KYSE170S的m RNA表達(dá)量分別為0.892±0.075,0.703±0.034和0.365±0.036;COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在沉默ZIP5組KYSE170K的m RNA表達(dá)量分別為0.314±0.044,0.229±0.042和0.732±0.051,COX-2和Cyclin D1在m RNA水平表達(dá)分別下降了64.8%和67.4%,E-cadherin則上升了50.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 Western Blot結(jié)果顯示:COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在空載體組KYSE170S的蛋白表達(dá)量分別為0.654±0.036,0.873±0.075和0.256±0.064;COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在沉默ZIP5組KYSE170K的蛋白表達(dá)量分別為0.284±0.051,0.318±0.044和0.437±0.082,在沉默ZIP5后,COX-2和Cyclin D1在蛋白水平表達(dá)分別下降了56%和63%,E-cadherin則上升了41.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1 ZIP5在食管癌組織中高表達(dá),在癌旁組織中等表達(dá),在正常組織低表達(dá)。ZIP5表達(dá)與食管癌的分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。2 ZIP5和COX-2在食管癌中的表達(dá)具有相關(guān)性。3穩(wěn)定沉默ZIP5后,食管癌細(xì)胞KYSE170的增殖和侵襲能力受到明顯抑制。4穩(wěn)定沉默ZIP5后,食管癌細(xì)胞KYSE170的COX-2和Cyclin D1在m RNA和蛋白水平表達(dá)降低,E-cadherin在m RNA和蛋白水平表達(dá)上升。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

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本文編號：197599