本文選題：馬立克氏病病毒 + 微RNA��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：血清1型馬立克氏病病毒(Marek's disease virus serotype 1,MDV-1)是致瘤性α-皰疹病毒,在雞群中可引起以致死性T細(xì)胞淋巴瘤為特征的馬立克氏病(Marek's disease,MD)。雖然通過免疫接種可較好地控制MD,但MDV-1野毒分離株的毒力不斷增強(qiáng),并在免疫雞群中引發(fā)MD,已給世界養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。作為典型的致瘤性病毒,MDV-1的感染也為研究皰疹病毒引起腫瘤的生物學(xué)、遺傳學(xué)及免疫學(xué)提供了良好的動(dòng)物模型。microRNA(miRNA)是一類新的基因表達(dá)調(diào)控子,在多數(shù)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。已有研究發(fā)現(xiàn),在MDV-1的基因組中,14個(gè)miRNA前體基因,可加工成26個(gè)miRNA,并且集中分布于3個(gè)基因簇:Meq基因簇,Mid基因簇和LAT基因簇。目前,已有部分MDV-1 miRNA如miR-M4-5p、miR-M3-5p和miR-M7-5p被證明在MDV復(fù)制、潛伏、致病和/或致瘤過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。但對(duì)于其它大部分MDV-1 mi RNA,它們?cè)贛DV生物學(xué)中潛在的調(diào)控作用還不清楚。本研究首先系統(tǒng)分析MDV-1 miRNA在病毒感染宿主及MD淋巴瘤發(fā)生過程中的體內(nèi)動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜,并進(jìn)一步研究MDV-1 miRNA對(duì)病毒基因的自我調(diào)控作用。本論文的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1首先建立了檢測4個(gè)MDV蛋白編碼基因gB、ICP4、pp38、meq及全部26個(gè)病毒miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(realtime qRT-PCR)的方法,然后對(duì)MDV-1超強(qiáng)毒株GX0101感染宿主后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d和60 d的體內(nèi)動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,gB、ICP4、pp38、meq基因表達(dá)水平的第1個(gè)高峰出現(xiàn)在早期溶細(xì)胞感染階段(7 dpi),至潛伏階段(14 dpi)下降,隨后又上升,至晚期溶細(xì)胞感染階段(21 dpi)達(dá)到高峰,但在轉(zhuǎn)化與增生階段(30 60 dpi)gB、ICP4和pp38的表達(dá)水平逐漸下降,但meq仍保持較高表達(dá)水平,這些結(jié)果與“Cornell Model”描述的MD疾病發(fā)展過程基本一致,表明GX0101感染宿主的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是成功的。與gB、ICP4、pp38及meq基因的表達(dá)模式不同,依據(jù)26個(gè)MDV-1 miRNA在GX0101感染后的體內(nèi)動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜的差異,可將它們分為3類:第I類包括mi R-M4-5p、miR-M2-5p、miR-M2-3p等12個(gè)病毒miRNA,其表達(dá)水平自感染后即呈上升趨勢,并在14 21 dpi達(dá)到第一個(gè)高峰,隨后到30 dpi有所下降,然后在45 60 dpi又高水平表達(dá),可能與MD致病過程中的潛伏、晚期裂解感染和/或腫瘤增生有關(guān);另外12個(gè)miRNA如miR-M4-3p、miR-M7-5p和miR-M11-3p等組成第II類,盡管有些miRNA在45 dpi或60 dpi呈現(xiàn)稍微上升的趨勢,但其中大部分miRNA攻毒后的前1-2周以高水平表達(dá),隨后以低水平表達(dá),可能與MDV-1生活周期中的早期裂解感染和/或潛伏感染密切相關(guān);第III類包括2個(gè)miRNA miR-M5-5p和miR-M5-5p,未表現(xiàn)出一致的表達(dá)特征。2利用生物信息學(xué)方法對(duì)病毒miRNA與MDV病毒基因組進(jìn)行了預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)75個(gè)病毒蛋白編碼基因中存在357個(gè)潛在的病毒miRNA結(jié)合靶位點(diǎn)。這些候選靶基因的功能涉及基因調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期控制、免疫調(diào)節(jié)、病毒復(fù)制與傳播、蛋白磷酸化、DNA加工和修復(fù)等。本研究根據(jù)相關(guān)病毒基因功能及病毒miRNA的體內(nèi)動(dòng)態(tài)表達(dá)譜,優(yōu)先選擇了與蛋白磷酸化、DNA復(fù)制、基因調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化相關(guān)的候選靶基因10個(gè),成功構(gòu)建了11個(gè)miRNA前體表達(dá)載體和26個(gè)重組候選靶基因psiCHECKTM-2載體,然后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)30對(duì)候選靶基因3'-UTR靶點(diǎn)/mi RNA組合的相互作用分析,結(jié)果顯示其中5對(duì)3'-UTR靶位點(diǎn)和miRNA組合(MDV025和miR-M4-5p、meq和mi R-M5-3p、meq和miR-M7-5p、meq和miR-M11-5p、meq和miR-M12-5p)中的病毒miRNA能夠與對(duì)應(yīng)的3'-UTR靶點(diǎn)相互作用。qRT-PCR進(jìn)一步分析證實(shí)miR-M5-3p、miR-M7-5p、mi R-M11-5p和miR-M12-3p能夠共同靶向調(diào)控MDV原癌基因meq的表達(dá)。綜上所述,本研究系統(tǒng)揭示了MDV-1 mi RNA在病毒感染宿主的致病及淋巴瘤發(fā)展過程中的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜,為進(jìn)一步評(píng)估和研究MDV-1 miRNA的功能提供了重要的線索。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究證實(shí)miR-M5-3p、mi R-M7-5p、miR-M11-5p和miR-M12-3p能夠共同靶向調(diào)節(jié)MDV最重要致瘤基因meq的表達(dá),表明這些病毒miRNA在MEQ促進(jìn)腫瘤形成的過程中可能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步揭示它們調(diào)控MDV感染并致瘤的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
[Abstract]:Serotype 1 MDV - 1 , MDV - 1 , is an oncogenic alpha - herpesvirus , which can be caused in chicken flocks to cause death of T - cell lymphoma as a characteristic of disease ( MD ) . In this study , MDV - 1 miRNA , such as miR - M4 - 5p , miR - M3 - 5p and miR - M7 - 5p , has been shown to play an important role in the pathogenesis of MDV replication , latent , pathogenic and / or tumor . 鑷蟲櫄鏈熸憾緇嗚優(yōu)鎰熸煋闃舵(21 dpi)杈懼埌楂樺嘲,浣嗗湪杞寲涓庡鐢熼樁孌，

本文編號(hào)：1822208