本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：培養(yǎng)體系優(yōu)化　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：p BMSC是一種應(yīng)用廣泛的成體干細(xì)胞,具有自我更新以及多向分化的能力,在干細(xì)胞治療以及臨床應(yīng)用前有效性、安全性評估中具有重要意義。在體外長期培養(yǎng)過程中,p BMSC會(huì)逐漸出現(xiàn)增殖緩慢、衰老和分化等問題,此外非定向的干細(xì)胞治療引起的治療效果不穩(wěn)定等因素也是制約其在干細(xì)胞臨床應(yīng)用的主要原因。為實(shí)現(xiàn)p BMSC體外長期培養(yǎng)并維持其細(xì)胞增殖和分化潛能,并通過定向分化成特定細(xì)胞類型從而實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞定向治療,本研究通過培養(yǎng)體系優(yōu)化、i PS誘導(dǎo)以及定向分化等多個(gè)方面對p BMSC進(jìn)行深入研究,為其在基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞治療以及臨床應(yīng)用前安全性評估等方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:1、通過在p BMSC培養(yǎng)基中添加小分子化合物RG108和A83-01對培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化研究,結(jié)果顯示:(1)在培養(yǎng)基中持續(xù)添加1μmol/L A83-01,能夠顯著增加多能性基因Oct4和Nanog表達(dá)水平、增加端粒酶活性并且能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖;增加細(xì)胞抗凋亡基因表達(dá)量、減少凋亡基因表達(dá),并且能夠保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡刺激;提高p BMSC成脂分化效率,但對成骨分化并無顯著影響。(2)10μmol/L的RG108處理p BMSC 48h能夠顯著增加多能性基因Oct4和Nanog表達(dá)水平、增加端粒酶活性并且能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖;增加細(xì)胞抗凋亡基因表達(dá)量、減少凋亡基因表達(dá),并且能夠保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡刺激;顯著降低p BMSC中多能性基因啟動(dòng)子區(qū)域脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)甲基化水平;提高p BMSC成骨分化及成脂分化效率。2、通過比較誘導(dǎo)效率、重編程過程中多能性基因表達(dá)譜以及DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化等,研究了p BMSC向i PS誘導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示:(1)在p BMSC培養(yǎng)基中添加1μmol/L A83-01,能夠增加堿性磷酸酶陽性克隆數(shù)目,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,將i PS誘導(dǎo)效率從0.052%提高至0.0624%,但在誘導(dǎo)過程中對多能性基因表達(dá)譜并無顯著影響;(2)用10μmol/L RG108處理p BMSC 48h能夠顯著提高重編程效率至0.924%,將誘導(dǎo)天數(shù)從10d縮短至6d,并且在誘導(dǎo)過程中能夠極顯著提高多能性基因Oct4和Nanog表達(dá)量。RG108處理能夠降低p BMSC在誘導(dǎo)過程中多能性基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平,在D8時(shí)Oct4和Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平顯著低于同期對照組。3、通過高表達(dá)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的mi R-17/21/143和胰島細(xì)胞特異的mi R-375,探究其在成脂分化以及成IPC分化中的調(diào)控作用。結(jié)果顯示:(1)高表達(dá)mi R-17/21/143皆能夠促進(jìn)成脂分化,其中mi R-21對成脂分化促進(jìn)作用最為顯著;干擾mi R-17對成脂分化無明顯影響,但干擾mi R-21/143能夠顯著抑制p BMSC成脂分化標(biāo)記基因表達(dá)和成熟脂滴形成;將三種mi RNA進(jìn)行組合誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn),同時(shí)高表達(dá)三種mi RNA能夠極顯著的提高脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)效率;(2)mi R-375高表達(dá)慢病毒載體能夠有效將p BMSC誘導(dǎo)成雙硫腙染色呈陽性的細(xì)胞克隆;在誘導(dǎo)過程中Oct4基因表達(dá)量顯著下降,內(nèi)胚層基因SOX17在D5先升高隨后又再次下降,IPC標(biāo)記基因表達(dá)量顯著升高;對所獲得的IPC進(jìn)行經(jīng)葡萄糖刺激檢測顯示,該細(xì)胞具有分泌胰島素及C肽能力。本研究通過對p BMSC體外長期培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化并對其進(jìn)行i PS誘導(dǎo)效率比較分析,隨后利用mi RNA對p BMSC進(jìn)行成脂及成IPC分化誘導(dǎo),旨在為p BMSC作為細(xì)胞重編程、i PS誘導(dǎo)和定向分化等方面研究中的優(yōu)越性提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),p BMSC的研究為其在基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞治療以及臨床應(yīng)用前安全性評估等奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The results showed that : ( 1 ) By adding small molecule compounds RG108 and A83 - 01 into the culture medium , the research results showed that : ( 1 ) By adding small molecule compounds RG108 and A83 - 01 into the culture medium , the research results showed that : ( 1 ) By adding small molecule compounds RG108 and A83 - 01 into the culture medium , the research results showed that : The results showed that : ( 1 ) The high expression of mi R - 17 / 21 / 143 could significantly increase the DNA methylation level of the promoter region of pBMSC . The results showed that : ( 1 ) The high expression of mi R - 17 / 21 / 143 could significantly increase the DNA methylation level of the promoter region of pBMSC . The results showed that : ( 1 ) The high expression of mi R - 17 / 21 / 143 could significantly inhibit the expression of polygenic gene Oct4 and Nanog . ( 2 ) The high - expression lentivirus vector of mi R - 375 was able to effectively clone p - BMSC into a positive cell clone . In the induction process , the expression of Oct4 gene was significantly decreased , and the expression of gene SOX17 increased and decreased again after the induction . The results showed that the cell had the ability to secrete insulin and C - peptide .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q813

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本文編號：1724970