本文關(guān)鍵詞：定量PCR方法與流式成像技術(shù)在亞歷山大藻藻華研究中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國科學院研究生院(海洋研究所)》 2015年

定量PCR方法與流式成像技術(shù)在亞歷山大藻藻華研究中的應(yīng)用

高巖  

【摘要】：有害藻華(harmful algal bloom,HAB)是近海常見的一類海洋生態(tài)災(zāi)害現(xiàn)象。部分有害藻華原因種能夠產(chǎn)生藻毒素,其中,麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins,PST)在全球分布最廣、危害也最為嚴重。甲藻中的有毒亞歷山大藻是海洋中麻痹性貝類毒素的重要來源,在亞歷山大藻研究中,如何針對有毒藻種開展特異性檢測,獲取長期、連續(xù)的觀測資料,對于剖析亞歷山大藻藻華成因、防控藻華危害效應(yīng)至關(guān)重要。塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種(Alexandrium tamarense species complex)是一類重要的有害藻華原因種,在我國近海多次形成藻華。本研究針對我國近海的有毒塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種,首次將針對特定產(chǎn)毒藻種和麻痹性貝類毒素產(chǎn)毒基因qPCR檢測方法應(yīng)用于近海亞歷山大藻藻華研究;并在留學基金委支持下,在美國開展了應(yīng)用Imaging FlowCytobot(IFCB)進行亞歷山大藻藻華原位觀測的研究,取得了以下認識:(1)針對中國近海塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種的兩種有毒藻種--A.fundyense(I核糖體型)和A.pacificum(IV核糖體型),分別建立了基于TaqMan探針的qPCR檢測方法,并對該方法進行了特異性、靈敏度和準確性驗證。將qPCR方法與傳統(tǒng)的顯微鏡檢測方法及麻痹性貝類毒素高效液相色譜分析技術(shù)相結(jié)合,在亞歷山大藻藻華多發(fā)的長江口鄰近海域及黃渤海海域開展了調(diào)查和研究。根據(jù)2011年春季和2012年春季在長江口鄰近海域及黃渤海的調(diào)查結(jié)果,發(fā)現(xiàn)A.pacificum主要分布在長江口鄰近海域,是該海域亞歷山大藻中的優(yōu)勢藻種和麻痹性貝類毒素的主要來源,另外在渤海秦皇島附近海域也有少量該藻種存在;而A.fundyense是黃海海域亞歷山大藻的優(yōu)勢種,主要分布在34oN以北海域。該研究首次闡明了兩種有毒亞歷山大藻(A.fundyense和A.pacificum)在我國近海不同的分布特征,也顯示了qPCR檢測方法良好的特異性、靈敏度及其在亞歷山大藻生態(tài)學研究中的應(yīng)用潛力。(2)將一種針對產(chǎn)毒基因sxt A4的qPCR檢測方法應(yīng)用于黃海和長江口鄰近海域的麻痹性貝類毒素產(chǎn)毒藻檢測,并與該海域有毒藻種檢測結(jié)果和麻痹性貝類毒素分析結(jié)果進行了對比。發(fā)現(xiàn)基于sxt A產(chǎn)毒基因的qPCR方法檢測結(jié)果與有毒塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種(A.fundyense和A.pacificum)的豐度顯著相關(guān)(r2值為0.73,P0.05),表明有毒塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種是調(diào)查期間該海域主要的產(chǎn)毒藻種。調(diào)查海域麻痹性貝類毒素的分布狀況與兩種qPCR方法得到的有毒藻分布狀況基本一致,但藻毒素水平與有毒藻豐度之間缺乏良好的相關(guān)性。該研究首次將基于產(chǎn)毒基因的檢測方法應(yīng)用于我國近海麻痹性貝類毒素有毒藻種檢測,結(jié)果表明該方法適合于我國近海麻痹性貝類毒素產(chǎn)毒藻的監(jiān)測,具有良好的應(yīng)用前景,該方法與毒素化學分析手段相結(jié)合,將更有利于對有毒藻種的早期監(jiān)測和預(yù)警。(3)應(yīng)用IFCB,開展了美國Cape Cod地區(qū)Salt Pond中有毒亞歷山大藻A.fundyense藻華動態(tài)的研究,并對比分析了64子集和80子集分類系統(tǒng)對藻華種類的識別情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),64子集分類系統(tǒng)對A.fundyense的自動檢測結(jié)果好于80子集分類系統(tǒng),與手動校正結(jié)果比較,r2值可達0.958。根據(jù)IFCB檢測結(jié)果,獲得了A.fundyense藻華全程觀測數(shù)據(jù),揭示了藻華末期A.fundyense的有性生殖過程及寄生甲藻對藻華消亡的影響。此外,還發(fā)現(xiàn)了由異帽藻(Heterocapsa triquetra)形成的藻華,最高豐度可達107 cells L-1。上述結(jié)果表明,IFCB是一種具有良好應(yīng)用潛力的藻華原位觀測技術(shù),其應(yīng)用有助于認識藻華動態(tài)過程、探索藻華生消機制�？傊�,本研究將針對特定有毒藻種和產(chǎn)毒基因的qPCR方法應(yīng)用于渤、黃、東海的有毒塔瑪亞歷山大藻研究,首次闡明了兩種麻痹性貝類毒素產(chǎn)毒藻在該海域的分布格局,揭示了該海域麻痹性貝類毒素的主要來源,也證明了分子生物學方法在有害藻華生態(tài)學研究中的意義和價值。此外,應(yīng)用全自動原位觀測設(shè)備IFCB開展了亞歷山大藻藻華動態(tài)的探索性研究,揭示了A.fundyense有性生殖過程及寄生甲藻對藻華消亡的影響。研究結(jié)果深化了對我國近海有毒亞歷山大藻藻華的認識,也為開展亞歷山大藻藻華的監(jiān)測和研究提供了重要的方法學依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q949.2;X55
【目錄】：

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