本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒HX株的分離與鑒定及其PL蛋白對(duì)抗IFN-β的分子機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

豬傳染性胃腸炎病毒HX株的分離與鑒定及其PL蛋白對(duì)抗IFN-β的分子機(jī)制

胡曉亮  

【摘要】：豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)是引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)的病原。臨床方面表現(xiàn)為嚴(yán)重脫水、嘔吐和水樣腹瀉,是一種高度接觸性和急性傳染病。各年齡段的豬對(duì)TGEV都易感,特別能夠引起兩周齡以下的仔豬死亡,致死率為100%。TGE流行范圍非常廣,發(fā)病率和致死率極高,是我國(guó)和其他國(guó)家仔豬死亡的重要疫病之一,并且給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)從黑龍江省哈爾濱市周邊某豬場(chǎng)收集腹瀉仔豬的糞便通過TGEV的N基因引物進(jìn)行RT-PCR鑒定,擴(kuò)增到一段約1100 bp的基因序列,同時(shí)用PRRSV、PEDV和PRV的引物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)沒有擴(kuò)增到目的基因,將擴(kuò)增得到的目的基因與p MD18-T載體連接后進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果表明該基因序列與TGEV核苷酸序列相似性為98.5%,這說明腹瀉仔豬的糞便中含有TGEV。將該糞便病料經(jīng)適當(dāng)離心,0.22μm過濾后接種PK15細(xì)胞。經(jīng)過盲傳8代后細(xì)胞出現(xiàn)典型病變,利用透射電鏡觀察確定該病毒的形態(tài)是有囊膜的冠狀病毒,直徑大小在80~100 nm,將該病毒分離株命名為TGEV-HX株。分別設(shè)計(jì)10對(duì)引物對(duì)HX株進(jìn)行全基因組測(cè)序,可以成功拼接成28580 bp,基因組上依次為5’-UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-E-N-ORF7-3’UTR。與國(guó)內(nèi)分離株同源性很高,遺傳進(jìn)化樹分析顯示HX株與Purdue在同一個(gè)進(jìn)化分支,與疫苗株H165進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。固有免疫是宿主抵御微生物入侵的第一道防線,主要過程分為干擾素(IFNs)合成通路和IFNs信號(hào)通路,IFNs與相應(yīng)受體結(jié)合后激活JAK/STAT途徑,進(jìn)而激活I(lǐng)SGs產(chǎn)生,最終導(dǎo)致抗病毒感染平臺(tái)產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)通過利用TGEV HX和UV-TGEV HX分不同時(shí)間段分別感染PK-15,收集細(xì)胞后提取總RNA后,采用q RT-PCR方法檢測(cè)IFN-α1,IFN-β,IL6,IL12,TNF-α,IRF7,Mx1,ISG56,STAT1和β-actin的轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而分析TGEV HX與固有免疫細(xì)胞因子之間的相互關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGEV HX能夠通過其自身復(fù)制抑制IFN-α1,IFN-β,TNF-α,IRF7和ISG56的轉(zhuǎn)錄,對(duì)于IL6,IL12和STAT1轉(zhuǎn)錄水平與UV-TGEV相當(dāng),而TGEV能夠誘導(dǎo)高水平的Mx1基因轉(zhuǎn)錄。這說明TGEV利用其自身復(fù)制調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而完成病毒復(fù)制和傳播。所有冠狀病毒都編碼木瓜樣蛋白酶(PL),負(fù)責(zé)將病毒早期ORF1合成的多聚蛋白切割開來,是病毒復(fù)制必需基因。SARS,NL63,PEDV和MHV中都發(fā)現(xiàn)PL蛋白有抑制IFN-β通路的作用,而TGEV也存在PL蛋白,且晶體結(jié)構(gòu)分析表明TGEV PL與SARS PL結(jié)構(gòu)相似,說明存在相似的功能。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TGEV PL蛋白能夠抑制IFN-β的合成并且不依賴于其催化活性。PL能夠定位于線粒體中不能影響STING形成的二聚體,但是具有去泛素化功能能夠?qū)IG-1和STING蛋白去泛素化阻止向下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。綜上,本實(shí)驗(yàn)成功分離TGEV地方流行毒株TGEV HX株,對(duì)該病毒的流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室診斷和病毒的生物學(xué)特征進(jìn)行研究;TGEV HX能夠通過自身復(fù)制調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄從而有利于自身復(fù)制;TGEV HX PL能夠通過去泛素化功能抑制IFN-β的產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

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