本文選題：巨核細(xì)胞發(fā)育　切入點(diǎn)：血小板生成　出處：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自噬是細(xì)胞降解部分胞漿,長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器的重要途徑之一。它可以通過重新利用細(xì)胞內(nèi)的組分抵抗外界壓力促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化。自噬在造血干細(xì)胞中的缺失能導(dǎo)致多系血細(xì)胞的異常分化,許多血液病尤其是血小板相關(guān)疾病伴隨著自噬水平的上調(diào),包括特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和伴隨血小板減少的骨髓異常增生綜合征(MDS)。因此,近年來人們開始重視自噬影響巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成的研究工作。為了探究自噬對(duì)巨核細(xì)胞成熟及血小板生成的調(diào)節(jié)作用,我們主要利用了體外白噬調(diào)節(jié)劑及動(dòng)物模型觀察巨核細(xì)胞和血小板的變化。目的探究自噬紊亂對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育可能造成的影響,影響的具體階段以及發(fā)生機(jī)制。方法我們主要通過利用體外自噬流調(diào)節(jié)藥物雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)和體內(nèi)巨核細(xì)胞-血小板上自噬基因Atg7特異性敲除小鼠模型(Atg7flox/flox PF4-Cre)分別造成不同發(fā)育階段的巨核細(xì)胞的自噬紊亂和自噬缺失研究自噬對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育的影響。1.體外研究：首先在造血干細(xì)胞和成熟的巨核細(xì)胞階段加入雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)成功調(diào)節(jié)早期和晚期巨核細(xì)胞內(nèi)自噬的水平,通過western blot檢測(cè)經(jīng)典的自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ的蛋白表達(dá)予以確認(rèn)。然后,結(jié)合巨核細(xì)胞發(fā)育前、后期不同的特點(diǎn)依次檢測(cè)發(fā)育前期巨核細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)成熟,代表分化程度的膜蛋白CD41與CD61的表達(dá),前血小板的形成,血小板的釋放和發(fā)育后期巨核細(xì)胞產(chǎn)生前血小板的能力。2.體內(nèi)研究：檢測(cè)正常生理情況下Atg7flox/flox PF4-Cre小鼠與其同窩對(duì)照小鼠Atg7flox/flox的血小板數(shù)目,巨核細(xì)胞的成熟,以及在低劑量X射線輻照誘導(dǎo)條件下,小鼠獲得暫時(shí)性血小板減少癥之后的血小板恢復(fù)情況。3.機(jī)制初步探討：運(yùn)用western blot 及 Q-PCR的方法檢測(cè)調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的分子表達(dá),解釋自噬調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育的可能機(jī)制。結(jié)果我們?cè)谠蛛x的小鼠胎肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入雷帕霉素(Rap)誘導(dǎo)自噬或巴弗洛霉素(BafA)阻斷自噬,我們發(fā)現(xiàn)與溶劑對(duì)照組(DMSO)相比自噬被調(diào)節(jié)的兩組產(chǎn)生的多倍體巨核細(xì)胞數(shù)量明顯減少(Rap 54.8±0.6%, BafA 50.4±3.8%, Ctrl 71.1 ±2.0%, P＜0.05),同時(shí)代表巨核系分化的膜蛋白CD41和CD61表達(dá)(Rap1.0±0.1%, BafA 0.7±0.0%, Ctrl 5.2±0.1%, P0.001)及血小板釋放(Rap 0.4±0.3%,BafA 0.7±0.1%,Ctrl 8.5±0.5%,P0.05)均顯著性降低即用雷帕霉素(Rap)或巴弗洛霉素(BafA)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的自噬能抑制巨核細(xì)胞的細(xì)胞核的成熟及巨核系的分化。與此同時(shí),我們又檢測(cè)了不同處理組誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞內(nèi)調(diào)控整個(gè)造血系統(tǒng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1, CyclinD2以及P21的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)Rap和BafA處理組的胎肝誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞中GATA-1 (Rap 0.56±0.14, P0.05; BafA 0.40±0.06, P0.01), CyclinDl(Rap 0.44±0.03, P＜0.001; BafA 0.68±0.06, P＜0.01), CyclinD2(Rap 0.25±0.03, P＜0.001; BafA 0.35±0.02, P0.05)以及P21(Rap 0.04±0.02, P0.05; BafA 0.04±0.02, P0.05)的表達(dá)均比對(duì)照組(GATA-1:Ctrl 1.15±0.13; CyclinD1:Ctrl 1.0±0.07; CyclinD2:Ctrl 0.49±0.03; P21: Ctrl 0.16±0.03)有顯著性降低；接著我們又檢測(cè)了磷酸化的肌球蛋白輕鏈(P-MLC),發(fā)現(xiàn)Rap處理組MLC磷酸化水平與對(duì)照組相比有顯著性的增高并且該組的巨核細(xì)胞的大小也降低,但是我們?cè)贐afA處理組中并未發(fā)現(xiàn)MLC磷酸化水平和細(xì)胞大小的改變即雷帕霉素或巴弗洛霉素能影響胎肝來源的巨核細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1, CyclinD2以及P21,轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的表達(dá)及MLC的磷酸化水平。然而,我們?cè)诰藓思?xì)胞純化之后再在其培養(yǎng)基中加入Rap或BafA調(diào)節(jié)自噬,發(fā)現(xiàn)前血小板生成未出現(xiàn)異常,這與我們?cè)诰藓思?xì)胞-血小板自噬基因Atg7特異性敲除小鼠Atg7flox/flox PF4-Cre體內(nèi)觀察到的正常血小板計(jì)數(shù)和巨核細(xì)胞成熟的表型相符,同時(shí)自噬基因Atg7特異性敲除并不影響小鼠抵抗低劑量X射線輻照的血小板恢復(fù)情況。綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)表明在早期造血干細(xì)胞階段對(duì)自噬進(jìn)行干預(yù)調(diào)節(jié)能抑制巨核細(xì)胞發(fā)育及血小板的生成,提示我們?cè)撾A段可能是治療血小板減少的相關(guān)疾病潛在的靶點(diǎn)。結(jié)論在造血干細(xì)胞階段上調(diào)或者下調(diào)自噬能抑制巨核細(xì)胞發(fā)育的整個(gè)過程,巨核細(xì)胞的成熟受抑制會(huì)進(jìn)一步影響血小板的最終生成。自噬對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控主要通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CyclinD2、 P21以及RhoA下游分子MLC的磷酸化調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。在成熟的巨核細(xì)胞階段干擾自噬不會(huì)影響巨核細(xì)胞產(chǎn)生前血小板,巨核系自噬基因敲除造成的自噬缺失并不影響巨核細(xì)胞的發(fā)育以及小鼠抵抗外界低劑量射線輻照的血小板恢復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q25

【參考文獻(xiàn)】

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2 李文林,石小玉,李蓉,唐洪林;促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)阻斷劑在TPO促進(jìn)UT7細(xì)胞增殖和分化中的作用[J];中華血液學(xué)雜志;2005年05期

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本文編號(hào)：1647216