本文選題：黃瓜　切入點(diǎn)：澇脅迫　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：黃瓜(Cucumis sativusL.,2n=2x=14)為葫蘆科甜瓜屬一年生攀緣性草本植物,是我國露地和設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一。隨著全球氣候變暖和雨澇災(zāi)害的頻繁發(fā)生,澇已成為危害作物生長的重要制約因子。黃瓜根系具有入土淺、通氣組織不發(fā)達(dá)、吸收力弱、再生能力差等特點(diǎn),極易受到澇脅迫危害,造成產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降。因此,探明黃瓜對澇脅迫的遺傳與適應(yīng)機(jī)制,分離鑒定耐澇關(guān)鍵基因,創(chuàng)新耐澇種質(zhì)和選育耐澇品種,對生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)黃瓜具有重要理論意義和應(yīng)用價值。選擇精確可信且能夠穩(wěn)定遺傳的表型是定位耐澇基因及解析耐澇機(jī)制的關(guān)鍵。前期通過對大量不同生態(tài)類型的黃瓜遺傳資源耐澇性鑒定,篩選出耐澇品系Zaoer-N(華南型)和不耐澇品系Pepino(美國露地型)。對這兩個品系連續(xù)多年淹澇觀察均發(fā)現(xiàn)Zaoer-N的下胚軸形成不定根能力強(qiáng),而Pepino下胚軸上基本沒有或者只有極少量的不定根的形成。不定根是植物對淹澇脅迫最重要的適應(yīng)能力之一,它代替了由于淹澇導(dǎo)致的原生根死亡,有利于受澇器官獲得氧氣。本文以Zaoer-N和Pepino為材料,利用RNA-seq比較了兩者下胚軸淹澇48h后全基因組在轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)基因;利用iTRAQ技術(shù)比較了兩者下胚軸淹澇48h后的差異表達(dá)蛋白;以不定根數(shù)(Adventitious Root Numbers,ARN)為表型,進(jìn)行耐澇性遺傳分析及QTL初步定位,通過雙親重測序開發(fā)KASP標(biāo)記鑒定大群體F2的重組株,精細(xì)定位了主效QTLARN6.1并對目標(biāo)基因進(jìn)行了圖位克隆及功能鑒定;主要研究結(jié)果如下:1、RNA-seq共檢測到27,000個轉(zhuǎn)錄本,Zaoer-N在淹澇48 h與對照間共有1,494個差異基因(FDR≤0.05,Fold changes≥2),而Pepino在淹澇48h與對照間共有1,766個差異基因。通過生物信息學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)與碳水化合物利用(Carbohydrate mobilization),硝酸鹽吸收(Nitrate assimilation),激素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Hormone production and signaling pathways),轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors),細(xì)胞分化(Cell division)等相關(guān)的基因可能與澇脅迫下黃瓜不定根原基形成能力密切相關(guān)。2、利用iTRAQ技術(shù)鑒定到具有定量信息的蛋白5,508個,其中差異表達(dá)(FDR≤0.05、Fold changes≥2)蛋白146個;43個蛋白在雙親間表達(dá)趨勢一致,主要為脅迫響應(yīng)蛋白、氧化還原酶、亞鐵血紅素等;47個蛋白僅在Zaoer-N中被檢測到,主要為過氧化物酶、糖酵解/糖質(zhì)新生相關(guān)蛋白;56個蛋白只在Pepino中被檢測到,主要為碳水化合物分解蛋白和水解酶類;Zaoer-N下胚軸中差異蛋白與其對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本間的相關(guān)系數(shù)為0.26,Pepino下胚軸中差異蛋白與其對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本間的相關(guān)系數(shù)為0.18,均為顯著相關(guān)(p≤0.05,2-tailed)。3、通過主基因+多基因混合遺傳模型分析法對基于淹澇脅迫下的下胚軸不定根數(shù)進(jìn)行了遺傳分析。結(jié)果表明:不定根數(shù)的最適遺傳模型為D-4模型,即1對加性-顯性(相反)主基因+加性-顯性多基因模型。主基因與多基因加性效應(yīng)值均為正值,多基因顯性效應(yīng)值也為正值,黃瓜不定根數(shù)遺傳主要由主基因的加性和多基因的加性-顯性效應(yīng)控制。4、利用來源于黃瓜全基因序列的1,335對SSR引物,對親本進(jìn)行差異多態(tài)性篩選,得到155對多態(tài)性引物,多態(tài)率為11.6%;構(gòu)建了一張含有7個連鎖群、149個SSR標(biāo)記、平均遺傳距離為3.7 cM的遺傳圖譜,每個連鎖群與黃瓜染色體一一對應(yīng)。采用復(fù)合區(qū)間作圖法,共檢測到3個與澇脅迫條件下不定根數(shù)相關(guān)的QTLs,分別命名為ARN3.1、ARN5.1和ARN6.1;三個季節(jié)的重復(fù)檢測表明,僅位于Chr6上的主效QTLARN6.1在三個季節(jié)中均被重復(fù)檢測到,可解釋表型變異率分別為17.6%、24.0%和19.8%。5、依據(jù)對949株F2淹澇后不定根數(shù)的表型統(tǒng)計,選出50株不定根數(shù)最多(ARN40)的單株和50株不定根數(shù)最少(ARN≤5)的單株分別組成兩個極端混池,用 SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)法進(jìn)行簡化基因組測序。對兩個混池間通過測序所獲得的SNP分別計算△(SNP_indeX)和AEuclidean distance并進(jìn)行擬合回歸分析,最終獲得一個與主效QTLARRN6.1重合的關(guān)聯(lián)區(qū)間,并將ARN6.1縮短至～310 kb的區(qū)間。使用該區(qū)間的兩側(cè)翼標(biāo)記,從2,274株大F2群體中鑒定到了 33個重組株。利用雙親重測序結(jié)果,在區(qū)間內(nèi)增加了 11個KASP標(biāo)記以鑒定重組株基因型,結(jié)合重組株的ARN表型值,將ARN6.1精細(xì)定位至～61.5 kb的區(qū)間內(nèi),使用FGENESH軟件預(yù)測到12個候選基因。分析這12個基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),僅Csa65G504460在淹澇48h后的Zaoer-N下胚軸中顯著上調(diào)表達(dá)。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明:Zaoer-N下胚軸在淹澇處理24 h、36 h、48 h后Csa6G504460的相對表達(dá)量均顯著高于對照,而Pepino中該基因在處理與對照間各個時間點(diǎn)均無顯著差異;綜上,我們將該基因確定為候選基因。6、經(jīng) BLASTn 分析,Csa6G504460 編碼 AAA-ATPase(ATPase associated with various cellular activities)蛋白,在植物體內(nèi)具有結(jié)合并水解ATP的功能;序列比對發(fā)現(xiàn)雙親間該基因編碼區(qū)共有三個SNP,但僅位于cDNA第1,519 bp(N端)處的 SNP 為非同義突變(Zaoer-N:GA1519T/Asp,Pepino:GG1519 T/Gly);序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該非同義突變位于Csa6G504460蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi);對三十份黃瓜自交系淹澇后ARN表型與序列多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析表明:該非同義SNP的多態(tài)性能夠決定不定根表型;亞細(xì)胞定位結(jié)果表明:Csa6G504460蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中亦有少量分布;等位基因重組蛋白體外誘導(dǎo)、純化及ATPase活力測定結(jié)果表明:Csa6G504460Asp蛋白具有較強(qiáng)ATPase活力且水解ATP能力與蛋白酶(底物)劑量間具有正相關(guān)性,而Csa6G504460Gly蛋白則基本喪失了水解ATP的能力;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):澇脅迫條件下,抑制Zaoer-N下胚軸內(nèi)ATPase酶活力將導(dǎo)致其不定根形成能力喪失,而促進(jìn)Csa6G504460Asp表達(dá)則可誘導(dǎo)更多不定根形成;異源過量表達(dá)35S::Csa6G504460Asp導(dǎo)致擬南芥(T3代)種子萌發(fā)后主根生長速度顯著快于野生型(Col-0)株系,且側(cè)根形成時間更早,表明該基因具有調(diào)控根發(fā)育的能力。
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S642.2;S422

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1 許學(xué)文;黃瓜澇脅迫下不定根形成的組學(xué)及主效QTL ARN6.1精細(xì)定位與克隆研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

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本文編號：1644656