本文選題：多粘類芽孢桿菌　切入點：基因組重測序　出處：《山東農業(yè)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)是桿狀、產芽孢的革蘭氏陽性細菌,多分離自植物根際土壤。近年來,由于其顯著的植物促生功效和抑菌效果,被普遍認為是一種植物根際促生菌(plant-growth-promoting rhizobacteria,PGPR)。多粘類芽孢桿菌能產生多種抑制細菌和真菌生長的拮抗物質,如多粘菌素(polymyxin)、環(huán)桿菌素(circulin)、喬利肽菌素(jolipeptin)、多肽菌素(polypeptins)、谷纈菌素(gatavalin)和殺鐮孢菌素(fusaricidins)等多種抗生素,而且由于某些抗生素的合成方式屬于非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases,NRPS)合成的,這更加吸引了越來越多的研究者關注。本實驗室在前期工作中分離出一株多粘類芽孢桿菌,命名為SC2。該菌株對多種植物病原真菌和細菌均有顯著抑菌效果。然而,在實驗室培養(yǎng)環(huán)境下,SC2菌株的菌落形態(tài)表現出了極大的不穩(wěn)定性。研究發(fā)現,SC2-M1和SC2-M2是分離自SC2連續(xù)培養(yǎng)過程中的兩個自發(fā)突變株。與野生株SC2相比,SC2-M1和SC2-M2在形態(tài)上存在明顯差異,研究發(fā)現三者在產孢能力、鞭毛及運動性、菌落形態(tài)、多糖合成、拮抗能力、生物膜形成、營養(yǎng)物質利用能力及生長情況等方面均有明顯差異。通過基因組重測序和轉錄組測序的方法,獲得了更全面的基因組差異和轉錄組差異信息�；蚪M重測序結果顯示,與SC2相比,SC2-M1基因組上共發(fā)生了14處變異,包括10處SNV,3處Indel和1處SV;SC2-M2基因組上共發(fā)生了9處變異,包括7處SNV和2處Indel。對基因編碼區(qū)內的變異分析發(fā)現,直接涉及芽孢形成的基因只有發(fā)生在染色體3383926位置處spo0A的632位置GA的單核苷酸突變。該突變導致了Spo0A蛋白的211Arg替換為211His。spo0A是芽孢形成過程中起始階段的關鍵調節(jié)基因。通過對多種產芽孢菌株中Spo0A蛋白的氨基酸序列比對分析發(fā)現,211Arg是高度保守性的,參與了Spo0A蛋白HTH結構域與DNA靶序列的結合作用。對三株菌的轉錄組測序結果顯示,在SC2-M1和SC2-M2中涉及芽孢形成的基因表達水平大幅下調,尤其是受到Spo0A直接調控的spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、sigE和sigF都表現出明顯下調;然而,涉及芽孢形成初期的基因,包括spo0A在內的磷酸傳遞中繼系統(tǒng)的基因的表達水平都未顯示明顯差異。據此推測Spo0A的211Arg替換引起其調控功能失活是導致芽孢形成受阻的關鍵原因。分別在SC2-M1和SC2-M2中進行了spo0A的功能回補實驗。利用自殺質粒介導的DNA同源重組系統(tǒng)將Spo0A突變的211His重新恢復至野生型211Arg;同時,在SC2-M2中又將211His分別替換為211Asp和211Ala,觀察重組菌株的芽孢形成情況。結果表明,只有當211位置為Arg時,SC2-M2的產孢能力才得以恢復。本實驗不僅證實了多粘類芽孢桿菌SC2菌株產孢能力的喪失是由基因組中spo0A基因632位置發(fā)生GA點突變引起的,而且進一步證明了Spo0A蛋白211Arg對其功能的必需性。除spo0A基因的變異直接影響突變株的芽孢形成差異以外,對兩突變株上的其他突變進行了分析,找到了有可能影響如鞭毛和運動性、胞外多糖合成、殺鐮孢菌素合成水平等方面的關鍵基因,全面的闡述了突變菌株與野生株的表型差異主要是由于基因組的變異引起的。揭示芽孢形成分子機制不僅是基本的生物學問題,而且對于芽孢桿菌在農業(yè)生產中的應用具有十分重要的實踐價值。本研究為多粘類芽孢桿菌芽孢形成的生理過程提供了豐富的遺傳背景信息,獲得的基因組重測序數據和轉錄組數據對進一步開展多粘類芽孢桿菌SC2菌株的功能基因組學研究奠定了良好基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q93

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本文編號：1637636