本文關(guān)鍵詞： 家蠶 BmREEPa 膽固醇 BmNPV 侵染　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：桿狀病毒是一類有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其基因組大小為80-180 kb,以節(jié)肢動(dòng)物為其專一宿主,被廣泛的用作昆蟲(chóng)殺蟲(chóng)劑,同時(shí)也被用作基因治療的轉(zhuǎn)移載體和真核表達(dá)載體。桿狀病毒隸屬Baculoviridae,根據(jù)其不同的形態(tài)學(xué)特征可將其劃分為核型多角體病毒(NPV)和顆粒體病毒(GV)兩類;根據(jù)其對(duì)宿主的特異性又可劃分為Alpha桿狀病毒、Beta桿狀病毒、Gamma桿狀病和Delta桿狀病毒四類。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一類典型的NPV病毒,它所引起的核型多角體病(血液型膿病)對(duì)養(yǎng)蠶業(yè)的危害極其嚴(yán)重,其造成的經(jīng)濟(jì)損失占整個(gè)蠶病損失的70%左右,嚴(yán)重影響了蠶絲的產(chǎn)量和質(zhì)量,減少了蠶農(nóng)的收入,威脅了我國(guó)蠶絲業(yè)的穩(wěn)定和在國(guó)際市場(chǎng)上的主導(dǎo)地位。近年來(lái),隨著對(duì)BmNPV研究的深入,部分與BmNPV抗性相關(guān)的家蠶基因被鑒定出來(lái),但是BmNPV的入侵機(jī)制始終未能解析清楚。本實(shí)驗(yàn)室建立并保存了兩株來(lái)源于同一品種家蠶幼蟲(chóng)卵巢組織,但對(duì)BmNPV感染的敏感性存在顯著差異的細(xì)胞系—BmN-SWU1和BmN-SWU2,其中BmN-SWU1細(xì)胞對(duì)BmNPV的感染極其敏感,而B(niǎo)mN-SWU2對(duì)BmNPV具有明顯的抗性。在前期關(guān)于兩株細(xì)胞系的差異研究中,發(fā)現(xiàn)BmN-SWU1和BmN-SWU2細(xì)胞系對(duì)BmNPV感染敏感性的差異主要是BmNPV入侵BmN-SWU2細(xì)胞的過(guò)程受到限制。本研究通過(guò)iTRAQ蛋白定量技術(shù)對(duì)BmN-SWU1和BmN-SWU2兩株細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組差異進(jìn)行了比較分析,篩選差異的膜蛋白特別是與受體功能相關(guān)的膜蛋白,期望通過(guò)對(duì)這些膜蛋白的研究來(lái)解釋造成這一差異的主要原因,為闡明BmNPV入侵的詳細(xì)過(guò)程奠定基礎(chǔ),也為從源頭控制BmNPV的感染提供理論依據(jù)。主要的研究成果如下:1.BmN-SWU1和BmN-SWU2兩株細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組差異分析本部分通過(guò)iTRAQ蛋白定量技術(shù)對(duì)兩株細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析,通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定到18952個(gè)肽段,匹配到的蛋白質(zhì)數(shù)量為3955個(gè),并對(duì)所有鑒定出的蛋白進(jìn)行g(shù)o功能注釋分析。然后以bmn-swu2為對(duì)照對(duì)bmn-swu1和bmn-swu2兩個(gè)樣品的的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行比較,共檢測(cè)到629個(gè)差異蛋白,其中348個(gè)上調(diào)蛋白,281個(gè)下調(diào)蛋白。對(duì)這些差異表達(dá)的蛋白進(jìn)一步篩選得到4個(gè)膜蛋白,對(duì)篩選到的膜蛋白進(jìn)行深入的分析,鑒定到一個(gè)差異倍數(shù)大于5,且可能具有增強(qiáng)膜上受體功能作用的膜蛋白——bgibmga013777。熒光定量pcr檢測(cè)的結(jié)果也證實(shí)該基因在bmn-swu2中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于其在bmn-swu1中的表達(dá)量,由此我們將該蛋白鎖定為目的蛋白。2.bmreepa基因的鑒定及定位分析受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白(reep)是一類與細(xì)胞表面受體功能有關(guān)并且參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白,這一家族在不同物種之間高度保守。reep家族成員均包含一個(gè)tb2/dp1,hva22結(jié)構(gòu)域及2-3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在脊椎動(dòng)物中reep家族一般存在5-6個(gè)成員分別命名為reep1-reep6,并且被劃分成兩個(gè)亞家族reep1-reep4和reep5-reep6,而無(wú)脊椎動(dòng)物中reep家族的成員一般為2個(gè)。本部分通過(guò)對(duì)bmreepa基因的序列分析發(fā)現(xiàn)該基因含有reep基因保守的tb2/dp1,hva22結(jié)構(gòu)域和三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;系統(tǒng)發(fā)生分析顯示bmreepa聚類在reep5-reep6亞家族中。通過(guò)免疫熒光和westernblotting分析發(fā)現(xiàn)該基因定位于細(xì)胞質(zhì)膜上且其n-末端伸向細(xì)胞外而c-末端面向細(xì)胞質(zhì);通過(guò)對(duì)該基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)其在家蠶五齡三天幼蟲(chóng)的中腸中和化蛹第一天時(shí)表達(dá)量最高,這一結(jié)果暗示該基因可能與脂類物質(zhì)的代謝或運(yùn)輸相關(guān)。3.bmreepa基因?qū)mnpv入侵的影響本部分通過(guò)在敏感細(xì)胞系bmn-swu1和抗性細(xì)胞系bmn-swu2中分別干涉和過(guò)表達(dá)bmreepa基因,探索細(xì)胞水平bmreepa基因?qū)mnpv入侵的影響,結(jié)果顯示:在bmn-swu1中干涉bmreepa可以明顯的抑制bmnpv對(duì)bmn-swu1細(xì)胞的感染;在bmn-swu2中過(guò)表達(dá)bmreepa可以一定程度上解除bmn-swu2對(duì)bmnpv入侵的抑制作用;同時(shí)bmreepa可以與bmnpv入侵的關(guān)鍵囊膜蛋白gp64發(fā)生相互作用。利用顯微注射技術(shù)創(chuàng)制了bmreepa干涉的家蠶品系,通過(guò)注射和口服感染兩種方式使轉(zhuǎn)基因品系和非轉(zhuǎn)基因品系家蠶幼蟲(chóng)感染bmnpv,然后通過(guò)致死率分析及病毒基因表達(dá)分析來(lái)驗(yàn)證該基因在個(gè)體水平對(duì)bmnpv感染的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)bmreepa干涉的家蠶品系中bmnpv的感染能力相比于非轉(zhuǎn)基因家蠶品系被明顯的抑制,且這種抑制主要存在于二次感染的過(guò)程中,即bv粒子對(duì)其它組織的感染。4.bmreepa相互作用蛋白鑒定本部分以bmreepa蛋白為誘餌蛋白通過(guò)免疫共沉淀的方法對(duì)bmreepa的相互作用蛋白進(jìn)行了篩選,鑒定到一個(gè)具有受體特性且與膽固醇運(yùn)輸相關(guān)的蛋白bmptchd;通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)BmREEPa、BmPtchd以及GP64可以形成一個(gè)蛋白復(fù)合體。通過(guò)研究BmREEPa和BmPtchd基因與膽固醇之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞膽固醇升高時(shí),BmREEPa和BmPtchd基因的表達(dá)量均上調(diào),而當(dāng)細(xì)胞膽固醇被移除時(shí)BmPtchd基因的表達(dá)量下調(diào),而B(niǎo)mREEPa的表達(dá)量依舊上調(diào)。由此推測(cè):BmREEPa可能在膽固醇代謝運(yùn)輸以及合成過(guò)程中都發(fā)揮作用,而B(niǎo)mPtchd基因可能僅在膽固醇代謝運(yùn)輸中發(fā)揮作用。本研究的結(jié)果表明,BmREEPa定位于細(xì)胞質(zhì)膜上,且其N-末端對(duì)其定位具有重要的作用;該基因不論在細(xì)胞水平還是個(gè)體水平都對(duì)BmNPV的入侵具有影響,且這種影響主要針對(duì)于BV的感染;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該基因與細(xì)胞膽固醇的調(diào)節(jié)也有密不可分的關(guān)系,而膽固醇又是BmNPV入侵不可缺失的因子。綜上所述,BmREEPa在整個(gè)BmNPV入侵的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,此結(jié)果不僅為闡明BmNPV入侵的詳細(xì)機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為REEP基因的研究提供了一個(gè)新的方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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