發(fā)布時間：2018-03-02 03:30

  本文關鍵詞： 家蠶 BmREEPa 膽固醇 BmNPV 侵染　出處：《西南大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：桿狀病毒是一類有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其基因組大小為80-180 kb,以節(jié)肢動物為其專一宿主,被廣泛的用作昆蟲殺蟲劑,同時也被用作基因治療的轉移載體和真核表達載體。桿狀病毒隸屬Baculoviridae,根據其不同的形態(tài)學特征可將其劃分為核型多角體病毒(NPV)和顆粒體病毒(GV)兩類;根據其對宿主的特異性又可劃分為Alpha桿狀病毒、Beta桿狀病毒、Gamma桿狀病和Delta桿狀病毒四類。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一類典型的NPV病毒,它所引起的核型多角體病(血液型膿病)對養(yǎng)蠶業(yè)的危害極其嚴重,其造成的經濟損失占整個蠶病損失的70%左右,嚴重影響了蠶絲的產量和質量,減少了蠶農的收入,威脅了我國蠶絲業(yè)的穩(wěn)定和在國際市場上的主導地位。近年來,隨著對BmNPV研究的深入,部分與BmNPV抗性相關的家蠶基因被鑒定出來,但是BmNPV的入侵機制始終未能解析清楚。本實驗室建立并保存了兩株來源于同一品種家蠶幼蟲卵巢組織,但對BmNPV感染的敏感性存在顯著差異的細胞系—BmN-SWU1和BmN-SWU2,其中BmN-SWU1細胞對BmNPV的感染極其敏感,而BmN-SWU2對BmNPV具有明顯的抗性。在前期關于兩株細胞系的差異研究中,發(fā)現(xiàn)BmN-SWU1和BmN-SWU2細胞系對BmNPV感染敏感性的差異主要是BmNPV入侵BmN-SWU2細胞的過程受到限制。本研究通過iTRAQ蛋白定量技術對BmN-SWU1和BmN-SWU2兩株細胞系的蛋白質組差異進行了比較分析,篩選差異的膜蛋白特別是與受體功能相關的膜蛋白,期望通過對這些膜蛋白的研究來解釋造成這一差異的主要原因,為闡明BmNPV入侵的詳細過程奠定基礎,也為從源頭控制BmNPV的感染提供理論依據。主要的研究成果如下:1.BmN-SWU1和BmN-SWU2兩株細胞系的蛋白質組差異分析本部分通過iTRAQ蛋白定量技術對兩株細胞系進行了蛋白質組分析,通過質譜分析鑒定到18952個肽段,匹配到的蛋白質數(shù)量為3955個,并對所有鑒定出的蛋白進行go功能注釋分析。然后以bmn-swu2為對照對bmn-swu1和bmn-swu2兩個樣品的的蛋白質豐度進行比較,共檢測到629個差異蛋白,其中348個上調蛋白,281個下調蛋白。對這些差異表達的蛋白進一步篩選得到4個膜蛋白,對篩選到的膜蛋白進行深入的分析,鑒定到一個差異倍數(shù)大于5,且可能具有增強膜上受體功能作用的膜蛋白——bgibmga013777。熒光定量pcr檢測的結果也證實該基因在bmn-swu2中的表達量遠低于其在bmn-swu1中的表達量,由此我們將該蛋白鎖定為目的蛋白。2.bmreepa基因的鑒定及定位分析受體表達增強蛋白(reep)是一類與細胞表面受體功能有關并且參與跨膜轉運的蛋白,這一家族在不同物種之間高度保守。reep家族成員均包含一個tb2/dp1,hva22結構域及2-3個跨膜結構域。在脊椎動物中reep家族一般存在5-6個成員分別命名為reep1-reep6,并且被劃分成兩個亞家族reep1-reep4和reep5-reep6,而無脊椎動物中reep家族的成員一般為2個。本部分通過對bmreepa基因的序列分析發(fā)現(xiàn)該基因含有reep基因保守的tb2/dp1,hva22結構域和三個跨膜結構域;系統(tǒng)發(fā)生分析顯示bmreepa聚類在reep5-reep6亞家族中。通過免疫熒光和westernblotting分析發(fā)現(xiàn)該基因定位于細胞質膜上且其n-末端伸向細胞外而c-末端面向細胞質;通過對該基因的表達模式分析發(fā)現(xiàn)其在家蠶五齡三天幼蟲的中腸中和化蛹第一天時表達量最高,這一結果暗示該基因可能與脂類物質的代謝或運輸相關。3.bmreepa基因對bmnpv入侵的影響本部分通過在敏感細胞系bmn-swu1和抗性細胞系bmn-swu2中分別干涉和過表達bmreepa基因,探索細胞水平bmreepa基因對bmnpv入侵的影響,結果顯示:在bmn-swu1中干涉bmreepa可以明顯的抑制bmnpv對bmn-swu1細胞的感染;在bmn-swu2中過表達bmreepa可以一定程度上解除bmn-swu2對bmnpv入侵的抑制作用;同時bmreepa可以與bmnpv入侵的關鍵囊膜蛋白gp64發(fā)生相互作用。利用顯微注射技術創(chuàng)制了bmreepa干涉的家蠶品系,通過注射和口服感染兩種方式使轉基因品系和非轉基因品系家蠶幼蟲感染bmnpv,然后通過致死率分析及病毒基因表達分析來驗證該基因在個體水平對bmnpv感染的影響,結果發(fā)現(xiàn)bmreepa干涉的家蠶品系中bmnpv的感染能力相比于非轉基因家蠶品系被明顯的抑制,且這種抑制主要存在于二次感染的過程中,即bv粒子對其它組織的感染。4.bmreepa相互作用蛋白鑒定本部分以bmreepa蛋白為誘餌蛋白通過免疫共沉淀的方法對bmreepa的相互作用蛋白進行了篩選,鑒定到一個具有受體特性且與膽固醇運輸相關的蛋白bmptchd;通過進一步的驗證發(fā)現(xiàn)BmREEPa、BmPtchd以及GP64可以形成一個蛋白復合體。通過研究BmREEPa和BmPtchd基因與膽固醇之間的關系發(fā)現(xiàn),當細胞膽固醇升高時,BmREEPa和BmPtchd基因的表達量均上調,而當細胞膽固醇被移除時BmPtchd基因的表達量下調,而BmREEPa的表達量依舊上調。由此推測:BmREEPa可能在膽固醇代謝運輸以及合成過程中都發(fā)揮作用,而BmPtchd基因可能僅在膽固醇代謝運輸中發(fā)揮作用。本研究的結果表明,BmREEPa定位于細胞質膜上,且其N-末端對其定位具有重要的作用;該基因不論在細胞水平還是個體水平都對BmNPV的入侵具有影響,且這種影響主要針對于BV的感染;同時還發(fā)現(xiàn)該基因與細胞膽固醇的調節(jié)也有密不可分的關系,而膽固醇又是BmNPV入侵不可缺失的因子。綜上所述,BmREEPa在整個BmNPV入侵的過程中發(fā)揮了重要的作用,此結果不僅為闡明BmNPV入侵的詳細機制奠定了基礎,同時也為REEP基因的研究提供了一個新的方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1554852