本文關(guān)鍵詞： 酶催化反應(yīng) 反應(yīng)機(jī)理 密度泛函方法 分子動(dòng)力學(xué)方法 量子力學(xué)與分子力學(xué)聯(lián)合方法　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：酶是所有生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。生命體中的每個(gè)細(xì)胞都是一個(gè)獨(dú)特的生化系統(tǒng),其中會(huì)發(fā)生成千上萬(wàn)的生化反應(yīng)。我們每一次吃飯、喝水、呼吸或者睡覺(jué)時(shí)發(fā)生的生化反應(yīng)都有酶的參與。這些酶是自然界中最好的催化劑,幾乎沒(méi)有人造的催化劑能夠超越它們。與一般催化劑相比,酶催化反應(yīng)通常在生理溫度和壓力下進(jìn)行,而且具有極高的催化效率。酶是化學(xué)家們最好的老師,通過(guò)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能的探討,可以深入研究酶的催化特性,從而擴(kuò)展酶在化學(xué)工業(yè)和日常生產(chǎn)生活中的應(yīng)用。研究酶催化反應(yīng)的難點(diǎn)之一是化學(xué)反應(yīng)通常非常快速以致于僅僅通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段很難獲得反應(yīng)機(jī)理的詳細(xì)信息。近年來(lái),隨著計(jì)算機(jī)硬件和軟件的飛速發(fā)展以及理論化學(xué)方法的日趨完善,計(jì)算化學(xué)在大尺度生化體系研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,現(xiàn)在已經(jīng)成為研究酶催化反應(yīng)機(jī)理的重要工具。本論文主要使用量子力學(xué)與分子力學(xué)組合(QM/MM)的方法系統(tǒng)地探討幾類重要的含鐵酶和糖相關(guān)酶的催化反應(yīng)機(jī)理。通過(guò)理論研究深入探討了酶與底物的作用機(jī)制和酶催化反應(yīng)的詳細(xì)歷程,確定了催化反應(yīng)的最優(yōu)路徑、反應(yīng)過(guò)程中涉及到的過(guò)渡態(tài)和中間體的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的能量學(xué)信息,明確了酶活性中心一些關(guān)鍵殘基的重要作用。研究結(jié)果不僅能夠與現(xiàn)有的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好地吻合,還對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做了進(jìn)一步的補(bǔ)充。這些理論研究對(duì)實(shí)驗(yàn)上探討相關(guān)酶的催化機(jī)理及實(shí)際應(yīng)用都有一定的指導(dǎo)意義。本論文的主要研究工作如下：(1)碳青霉烯合成酶(CarC)催化機(jī)理的理論研究碳青霉烯是p-內(nèi)酰胺類抗生素的一個(gè)重要分支,與其它p-內(nèi)酰胺類抗生素相比,碳青霉烯類的抗菌譜更廣,抗菌活性更強(qiáng),且對(duì)p-內(nèi)酰胺酶表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。然而,近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明細(xì)菌對(duì)碳青霉烯的抗藥性正在增加。因此,深入研究碳青霉烯的生物合成機(jī)制對(duì)制藥工程上設(shè)計(jì)新的碳青霉烯變體以抵抗細(xì)菌的抗藥性顯得尤為重要。簡(jiǎn)單的天然碳青霉烯-3-羧酸的生物合成只需要三種酶,其中一種是碳青霉烯合成酶(CarC)。CarC屬于FeⅡ和2-羰基酮戊二酸依賴的氧化酶家族,在碳青霉烯生物合成路徑中,CarC催化(3S,5S)-碳青霉烷發(fā)生C5-差向異構(gòu)化和C2/3-去飽和化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成(5R)-碳青霉烯�；谠缙贑lifton等人報(bào)道的晶體結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算都對(duì)差向異構(gòu)化和去飽和化機(jī)理進(jìn)行了研究。但是考慮到這個(gè)晶體結(jié)構(gòu)是不完整的,其中缺失了活性位點(diǎn)附近的兩部分關(guān)鍵loop區(qū),先前建議的反應(yīng)機(jī)理的合理性值得懷疑。最近,實(shí)驗(yàn)上報(bào)道了CarC的完整晶體結(jié)構(gòu),使得我們可以通過(guò)QM/MM計(jì)算探討其詳細(xì)的催化機(jī)理。我們首先分析了O2在金屬上的結(jié)合位點(diǎn),并識(shí)別出FeⅣ=O有兩種潛在的朝向：其氧基正對(duì)著His101或者正對(duì)著His251。前者能量上很不穩(wěn)定且不能與底物反應(yīng),但是它可以通過(guò)氧基的旋轉(zhuǎn)快速異構(gòu)化成后者。殘基Arg67在調(diào)控雙氧結(jié)合和協(xié)助FeⅣ=O異構(gòu)化方面起著重要作用。與早期理論計(jì)算建議的耦合的差向異構(gòu)化和去飽和化反應(yīng)不同,QM/MM計(jì)算結(jié)果明確支持分步的差向異構(gòu)化和去飽和化反應(yīng),整個(gè)催化反應(yīng)需要兩個(gè)完整的氧化循環(huán)。在差向異構(gòu)化反應(yīng)中,CarC催化(3S5S)-碳青霉烷轉(zhuǎn)化成初始產(chǎn)物(3S,5R)-碳青霉烷,反應(yīng)涉及到H5原子奪取、C5-自由基的翻轉(zhuǎn)和反向C5-H鍵的重建。在去飽和化反應(yīng)中,(3S,5R)-碳青霉烷以一個(gè)新的朝向重新結(jié)合進(jìn)CarC的活性位點(diǎn)。C2-C3去飽和化反應(yīng)中除了FeⅣ=O沒(méi)有涉及到任何活性位點(diǎn)殘基。計(jì)算結(jié)果表明與(3S,5S)-碳青霉烷相比,(3S,5R)-碳青霉烷中間體更適合作為CarC的底物。在CarC的作用下,(3S,5R)-碳青霉烷中間體可以通過(guò)高效的去飽和化反應(yīng)直接轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物(5R)-碳青霉烯。此外,在CarC催化反應(yīng)中,底物羥基化一直與目標(biāo)異構(gòu)化和去飽和化反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。我們的研究提供了詳細(xì)合理的CarC催化機(jī)理,這對(duì)碳青霉烯抗生素的生物合成工程有一定的指導(dǎo)意義。(2)工程細(xì)胞色素P450BM3酶催化機(jī)理的理論研究典型的P450酶通常催化O2參與的C/N-H鍵活化、烯烴環(huán)氧化、醛/酮烯化反應(yīng)等。與酶催化的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)類似,有機(jī)合成上經(jīng)常通過(guò)把等電子的卡賓轉(zhuǎn)移給烯烴來(lái)得到新的環(huán)丙烷產(chǎn)物,但是這種反應(yīng)在生物體內(nèi)幾乎不可能發(fā)生。受P450酶催化的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性的啟發(fā),Arnold課題組于2013年首次報(bào)道了P450BM3酶的工程變體催化烯烴的環(huán)丙烷化反應(yīng)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)工程P450酶還能催化C-H胺化反應(yīng)、硫亞胺化反應(yīng)、氮雜環(huán)丙烷化反應(yīng)等。這些研究不僅豐富了P450酶的應(yīng)用價(jià)值,也對(duì)實(shí)驗(yàn)上設(shè)計(jì)其他的一些新酶催化合成更多的自然界不常見(jiàn)的反應(yīng)提供了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。遺憾的是,到目前為止工程酶催化反應(yīng)機(jī)理的理論研究依然鮮有報(bào)道。以工程P450BM3酶催化的烯烴環(huán)丙烷化反應(yīng)為例,盡管實(shí)驗(yàn)上通過(guò)設(shè)計(jì)一些P450變體并使用不同的疊氮酯試劑和烯烴,已經(jīng)充分證明了這種反應(yīng)的可行性和可調(diào)性,但是并沒(méi)有從微觀水平上對(duì)環(huán)丙烷化反應(yīng)機(jī)理以及反應(yīng)的立體選擇性進(jìn)行更深層次的探索。在本章中,我們應(yīng)用QM和QM/MM方法詳細(xì)研究了工程P450BM3酶催化的苯乙烯環(huán)丙烷化機(jī)理以及反應(yīng)的立體選擇性。QM計(jì)算結(jié)果表明不管Fe-卟啉卡賓的軸向配體是巰基還是羥基,其基態(tài)都是三重自旋態(tài),這也與QM/MM計(jì)算結(jié)果一致。Fe-卟啉卡賓是一個(gè)高活性的中間體,在三重態(tài)勢(shì)能面上Fe-卟啉卡賓很容易與苯乙烯的末端烯基反應(yīng)生成一個(gè)C-自由基中間體,隨后C-自由基進(jìn)攻Fe-C鍵上的C原子得到最終的環(huán)丙烷化產(chǎn)物。反應(yīng)的立體選擇性只取決于疊氮酯試劑和苯乙烯在工程P450BM3酶活性中心的相對(duì)朝向,而不能僅僅從某一種固定的相對(duì)朝向出發(fā)通過(guò)在反應(yīng)中旋轉(zhuǎn)苯基或者酯基來(lái)實(shí)現(xiàn)。QM/MM計(jì)算進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),把工程P450BM3-CIS酶中Fe的軸向半胱氨酸配體突變成絲氨酸在一定程度上有利于cis產(chǎn)物的形成,這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。這些理論研究揭示了工程P450BM3酶催化的立體選擇性的本質(zhì),對(duì)實(shí)驗(yàn)上設(shè)計(jì)新的P450酶變體以提高反應(yīng)的立體選擇性具有重要的指導(dǎo)意義。(3)尿苷二磷酸連接糖氮-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(WIbB)催化機(jī)理的理論研究氮-乙�；D(zhuǎn)移酶(NAT)是最大的超酶家族之一,它能催化乙�；o酶A(acetyl-CoA)轉(zhuǎn)移其乙酰基到各式各樣的受體底物的氨基上。研究證實(shí)NAT參與很多的生理活動(dòng),例如：人體中致癌物的活化和解毒、細(xì)菌中氨基甙抗生素的滅活、組蛋白修飾以及脊椎動(dòng)物的睡眠-覺(jué)醒周期等。ManNAc3NAcA是一種不常見(jiàn)的雙氮-乙�；拿撗跆�,廣泛存在于一些革蘭氏陰性病菌的外膜中,其前驅(qū)體是UDP-ManNAc3NAcA,通常由五種酶聯(lián)合催化合成得到。第四種酶在Bordetella pertussis中也稱作WlbB,是一種氮-乙酰基轉(zhuǎn)移酶,它催化尿苷二磷酸-2-乙酰氨基-3-氨基-2,3-二脫氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAc3NA)轉(zhuǎn)變成尿苷二磷酸-2,3-二乙酰氨基-2,3-二脫氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAc3NAcA)。本文使用QM/MM方法探討了WIbB催化的乙�；瘷C(jī)理。乙�；磻�(yīng)是在底物的協(xié)助下完成的,沒(méi)有任何活性位點(diǎn)殘基直接參與。與實(shí)驗(yàn)上建議的氧負(fù)離子四面體中間體不同,通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)反應(yīng)會(huì)經(jīng)歷一個(gè)帶負(fù)電荷的CoA和一個(gè)帶正電荷的中間體。盡管殘基Asn84沒(méi)有直接參與酶催化反應(yīng),但是其在合理定位底物氨基上的孤電子對(duì)朝向及穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)和中間體方面起著重要作用。此外,理論研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)合理的初始酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)對(duì)準(zhǔn)確探討酶催化機(jī)理并獲得合理的能量關(guān)系至關(guān)重要。(4)脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶(DesIV)催化機(jī)理的理論研究脫氧糖是一類重要的碳水化合物,廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞表面的糖蛋白、脂多糖和糖脂中,也存在于很多微生物二級(jí)代謝產(chǎn)物中。D-脫氧糖胺就是一種典型的脫氧糖,它不僅參與很多的生命活動(dòng),還是一些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如酒霉素、嘌呤霉素和紅霉素等的重要組成部分。臨床研究表明在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中如果存在脫氧糖,它們的生物活性會(huì)明顯增強(qiáng)。相反,如果從這些藥物中移除脫氧糖,它們的藥理特性會(huì)被減弱甚至被消除。脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶(DesIV)是D-脫氧糖胺生物合成路徑中必需的一種酶,它催化脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖(dTDP-glucose)轉(zhuǎn)化成脫氧胸苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖(dTDP-4-keto-6-deoxy-glucose)。盡管實(shí)驗(yàn)上對(duì)DesIV的結(jié)構(gòu)和機(jī)理進(jìn)行了大量研究,但是依然有幾個(gè)機(jī)理上的重要爭(zhēng)議沒(méi)有得到解決。本文使用QM/MM方法深入研究了DesIV的催化機(jī)理。計(jì)算結(jié)果表明整個(gè)DesIV催化過(guò)程可以劃分為三個(gè)連續(xù)的化學(xué)步驟：氧化、脫水和還原,包含四個(gè)酶催化的基元反應(yīng)和一個(gè)非酶催化的烯醇-酮式互變異構(gòu)反應(yīng)。氧化步驟以一個(gè)協(xié)同異步的機(jī)理(質(zhì)子轉(zhuǎn)移先于氫負(fù)離子轉(zhuǎn)移)進(jìn)行,能壘是21.1 kcal/mol。脫水反應(yīng)需要?dú)埢鵊lu129和Asp128參與,反應(yīng)以一個(gè)分步的機(jī)理進(jìn)行,經(jīng)歷一個(gè)烯醇負(fù)離子中間體。在最后的還原步驟中,NADH把一個(gè)氫負(fù)離子轉(zhuǎn)移給糖基C6原子,同時(shí)Tyrl51自發(fā)地轉(zhuǎn)移一個(gè)質(zhì)子給C4-酮基,得到一個(gè)穩(wěn)定的烯醇作為酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物。一旦這個(gè)烯醇糖從酶活性中心釋放出來(lái)并進(jìn)入到溶劑中,在水分子協(xié)助下它很容易發(fā)生烯醇-酮式互變異構(gòu)轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的酮糖產(chǎn)物。這些計(jì)算結(jié)果為DesIV的機(jī)理研究提供了新的視角和啟示,也對(duì)其它同家族葡萄糖脫水酶的機(jī)理研究提供了一個(gè)可靠的理論基礎(chǔ)。(5)尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脫水酶(TunA)催化機(jī)理的理論研究尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脫水酶(TunA)是短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族的一個(gè)特殊成員,它催化尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)轉(zhuǎn)化成尿苷二磷酸-4-酮基-氮-乙酰葡糖胺-5,6-烯(UDP-4-keto-GlcN Ac-5,6-ene)。TunA是衣霉素生物合成路徑中必需的一種酶。衣霉素是一種重要的�；塑疹惪股�,它能夠抑制具有包膜的病毒的繁殖,是醫(yī)學(xué)上常用的抗生素之一。本文通過(guò)QM/MM計(jì)算詳細(xì)探討了TunA的催化機(jī)理。與DesIV類似,TunA催化反應(yīng)也可劃分成氧化、脫水和還原三個(gè)連續(xù)的化學(xué)步驟。氧化步是一個(gè)吸熱反應(yīng),能壘是21.6 kcal/mol,并且它以一個(gè)協(xié)同異步的機(jī)理進(jìn)行。脫水反應(yīng)以E1cB機(jī)理進(jìn)行,包含質(zhì)子轉(zhuǎn)移和羥基消除兩步。殘基Glu121先作為一個(gè)廣義堿然后再作為酸參與水的消除反應(yīng),而Cys120雖然沒(méi)有直接參與反應(yīng),但是它在維持活性位點(diǎn)排布方面起著重要作用。還原步是氧化反應(yīng)的逆反應(yīng),也是以協(xié)同異步機(jī)理進(jìn)行,只不過(guò)氫負(fù)離子轉(zhuǎn)移先于質(zhì)子轉(zhuǎn)移發(fā)生。通過(guò)理論計(jì)算我們修訂了先前實(shí)驗(yàn)上建議的TunA的催化機(jī)理,這能為其它SDR家族成員的催化機(jī)理研究提供一定的理論指導(dǎo)。(6)果膠酸裂解酶(BsPel)催化機(jī)理的理論研究膠質(zhì)不僅是植物細(xì)胞壁的重要組成部分,參與很多的生化過(guò)程,還是食品工業(yè)上廣泛使用的增稠劑和穩(wěn)定劑。在植物軟腐爛過(guò)程中,果膠酸裂解酶是解聚膠質(zhì)必不可少的一種酶,其催化聚半乳糖的α-1,4糖苷鍵裂解,產(chǎn)生4,5-不飽和的寡半乳糖。雖然實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)對(duì)很多植物致病菌中的果膠酸裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了大量的研究并取得了很多重要進(jìn)展,但到目前為止還沒(méi)有對(duì)其催化應(yīng)機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的理論研究。本章我們使用QM/MM方法詳細(xì)研究了Bacillus subtilis菌屬果膠酸裂解酶(BsPel)催化的反式β-消除機(jī)理。殘基Arg79作為催化堿奪取底物α-質(zhì)子,得到一個(gè)能量上很不穩(wěn)定的碳負(fù)離子中間體,其上的糖苷鍵很容易斷裂形成一個(gè)4,5-不飽和的半乳糖產(chǎn)物和一個(gè)帶負(fù)電的β-離去基團(tuán)。酶活性中心的Ca2+離子不僅能夠通過(guò)配位鍵使底物準(zhǔn)確結(jié)合進(jìn)酶的活性中心,還能有效地降低底物α-質(zhì)子的pKa值以促進(jìn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的發(fā)生。β-離去基團(tuán)的質(zhì)子化反應(yīng)中需要的質(zhì)子并不是來(lái)自于Arg84或者其它酶活性中心殘基,而是很有可能來(lái)自于溶劑水分子。此外,理論研究還發(fā)現(xiàn)QM區(qū)和Active區(qū)的選擇對(duì)準(zhǔn)確探討酶催化反應(yīng)至關(guān)重要。本論文的特色和創(chuàng)新之處：(1)使用QM/MM方法深入探討了碳青霉烯合成酶的催化機(jī)理,確定了02分子在輔因子Fe上的結(jié)合位點(diǎn)以及FeⅣ=O的潛在朝向,明確了分步的差向異構(gòu)化和去飽和化機(jī)理及反應(yīng)的詳細(xì)細(xì)節(jié),同時(shí)闡明了活性位點(diǎn)殘基的關(guān)鍵作用,對(duì)實(shí)驗(yàn)上研究碳青霉烯的生物合成路徑以及制藥工程上設(shè)計(jì)新的碳青霉烯變體以抵抗細(xì)菌的抗藥性具有重要的指導(dǎo)意義。(2)使用QM和QM/MM方法深入研究了工程P450BM3酶催化的烯烴環(huán)丙烷化機(jī)理,確定了反應(yīng)的具體細(xì)節(jié),明確了酶蛋白環(huán)境對(duì)環(huán)丙烷化立體選擇性的重要作用,進(jìn)一步探討了不同F(xiàn)e-卟啉軸向配體對(duì)立體選擇性的影響。這些研究為實(shí)驗(yàn)上設(shè)計(jì)新的P450酶變體以提高反應(yīng)的立體選擇性奠定了必要的理論基礎(chǔ)。(3)使用QM/MM方法系統(tǒng)研究了兩類葡萄糖脫水酶的催化機(jī)理,通過(guò)理論計(jì)算解決了機(jī)理研究上存在的幾個(gè)爭(zhēng)議,修訂了早期實(shí)驗(yàn)上建議的氧化-脫水-還原三步反應(yīng)機(jī)理,確定了反應(yīng)的最優(yōu)路徑及相關(guān)殘基的作用,這些結(jié)果對(duì)其它同家族葡萄糖脫水酶的機(jī)理研究具有一定的指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q55
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本文編號(hào)：1534832