發(fā)布時(shí)間：2018-02-24 02:11

  本文關(guān)鍵詞： 中國(guó)紅豆杉 JA信號(hào)通路 JAZ MYC2 ERF　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：茉莉酸(Jasmonate,JA)是植物體中廣泛存在并且具有高效調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源激素之一,尤其對(duì)萜類、生物堿類和黃酮類的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要的調(diào)控作用。但由于JA信號(hào)激素能夠同時(shí)引起細(xì)胞凋亡等一系列副反應(yīng),從而限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此,通過闡釋JA信號(hào)通路調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的模式,并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,不僅能夠提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量,而且能夠有效地避免副反應(yīng)損害。紫杉醇是中國(guó)紅豆杉體內(nèi)一類重要的二萜類物質(zhì),對(duì)于治療乳腺癌和卵巢癌具有良好的療效。但是,由于其生物體內(nèi)含量低且合成步驟復(fù)雜,從而嚴(yán)重制約了其商業(yè)化生產(chǎn)。本文對(duì)中國(guó)紅豆杉中JA信號(hào)調(diào)控紫杉醇生物合成模式進(jìn)行研究,以期為構(gòu)建紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。本文首先通過對(duì)中國(guó)紅豆杉中紫杉醇合成酶基因啟動(dòng)子上的順式作用元件進(jìn)行克隆和分析,然后以關(guān)鍵的JA信號(hào)響應(yīng)元件為誘餌,篩選與其相互作用的轉(zhuǎn)錄因子,從而闡明JA信號(hào)通路調(diào)控紫杉醇合成的下游模式。同時(shí),鑒定中國(guó)紅豆杉中的JA信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)JAZ(Jasmonate-ZIM domain)和MYC2因子,以研究中國(guó)紅豆杉中JA信號(hào)通路上游響應(yīng)的調(diào)控方式及其與下游響應(yīng)之間的相互作用。結(jié)合以上結(jié)果,從而能夠闡明JA信號(hào)調(diào)控紫杉醇生物合成的模式。取得的主要結(jié)果如下:(1)JA調(diào)控紫杉醇合成模式中的的靶點(diǎn)篩選。對(duì)TASY,T5H,T10H,T13H,TAT和T7H 6個(gè)紫杉醇合成酶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆和研究,發(fā)現(xiàn)E-box,G-box和T/G-box等JA-responsive順式作用元件廣泛存在于紫杉醇合成酶基因啟動(dòng)子上,表明MYC2是響應(yīng)JA信號(hào)并調(diào)控紫杉醇生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。其中,紫杉醇合成酶TASY基因啟動(dòng)子與PR(Pathogen-Related)、STR(Strictosidine synthase)、PMT2(putrescine N-methyltransferase 2)等JA響應(yīng)基因的啟動(dòng)子具有相同結(jié)構(gòu),即近端分布的T/G-box及串聯(lián)的G-box和GCC-box順式作用元件,說明TASY是JA調(diào)控紫杉醇合成模式中的的重要靶點(diǎn),同時(shí)也表明了ERF(Ethylene Responsive Factor)和MYC2轉(zhuǎn)錄因子在JA調(diào)控紫杉醇合成模式中具有重要作用。因此,本文以篩選調(diào)控tasy基因表達(dá)的erf和myc2為切入點(diǎn),然后進(jìn)一步揭示兩類轉(zhuǎn)錄因子在ja信號(hào)調(diào)控紫杉醇合成模式中發(fā)揮的作用。(2)與jre元件相互作用的tcerfs的克隆與功能分析。啟動(dòng)子活性分析表明t/g-box、cgtca-motif和gcc-box是tasy基因響應(yīng)ja的功能元件,其中g(shù)cc-box發(fā)揮了最關(guān)鍵作用。根據(jù)gcc-box能夠特異與erf類轉(zhuǎn)錄因子相互作用的特性,從中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得94個(gè)ap2/erebp轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中23個(gè)蛋白序列具有erf的特征堿基。分析meja處理前后兩個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn),表達(dá)量發(fā)生顯著變化的有13個(gè):其中4個(gè)表達(dá)量顯著上升,9個(gè)表達(dá)量顯著下調(diào)。利用序列分析等篩選得到兩個(gè)erf類轉(zhuǎn)錄因子tcerf12和tcerf15,兩者分別編碼典型的b1和b3類gcc-box-bindingerf轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交、紅豆杉細(xì)胞體內(nèi)共表達(dá)及超表達(dá)實(shí)驗(yàn)均表明,tcerf12和tcerf15能夠通過結(jié)合gcc-box而分別抑制和激活tasy基因的表達(dá)。(3)ja信號(hào)途徑上游基因tcmyc2的克隆及功能驗(yàn)證。在中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到具有完整的myc2轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)的tcmyc2,其蛋白序列與atmyc2、ntmyc2和crmyc2具有極高的相似性,進(jìn)化分析也表明它們具有極近的親緣關(guān)系,意味著tcmyc2在紅豆杉中有相似的作用。tcmyc2與tasy啟動(dòng)子順式作用元件的相互作用實(shí)驗(yàn)證明,tcmyc2能夠與t/g-box、g-box相互作用并進(jìn)而激活tasy基因表達(dá)。而且,tcmyc2不僅能夠激活tasy,t5h,tat,bapt,t13h等紫杉醇合成酶基因,還能夠激活tcerf12和tcerf15的表達(dá)。以上結(jié)果表明,tcmyc2對(duì)于響應(yīng)ja信號(hào)并調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成具有重要作用。(4)ja信號(hào)途徑上游基因tcjaz的克隆及功能驗(yàn)證。通過對(duì)紅豆杉中tcjaz基因的研究發(fā)現(xiàn),除groupv亞家族外,其他的jaz蛋白在裸子植物與被子植物中具有不同的進(jìn)化路徑。因此,挑選groupv亞家族中的tcjaz3作為研究紅豆杉中ja信號(hào)通路的目標(biāo)因子。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明,tcmyc2能夠與tcjaz3相互作用,tcjaz3能夠在紅豆杉體內(nèi)與tcmyc2結(jié)合從而抑制其活性。表明中國(guó)紅豆杉體內(nèi)同樣存在jaz-myc沉默體的調(diào)控模式。綜上,本文初步總結(jié)了以tcerf12/15、tcmyc2和tcjaz3為核心的ja信號(hào)調(diào)控中國(guó)紅豆杉紫杉醇生物合成的模式,為構(gòu)建高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或植株奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),本文初次報(bào)道了TcERF12響應(yīng)JA信號(hào)并負(fù)調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的現(xiàn)象,為完善JA信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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