本文關(guān)鍵詞： 糖綴合物 E.coli O86:B7 O-多糖 核心寡糖 ABOi　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：糖廣泛分布在自然界中的各種生物體中,并且發(fā)揮許多重要功能；其在生物體主要以糖綴合物的形式存在,與蛋白質(zhì)、脂等物質(zhì)共價鍵相連,形成糖蛋白／蛋白聚糖、糖脂等綴合物。糖鏈中單糖糖基間糖苷鍵形成的位置、構(gòu)型的不同、以及糖鏈修飾方式的不同,賦予糖綴合物高度多樣性和異質(zhì)性；不同細胞、組織器官所具有的多樣的糖綴合物賦予各細胞、組織器官不同的表型及功能。細菌細胞表面存在由諸多糖綴合物組成的糖萼,在細胞黏附及定植過程中發(fā)揮重要作用,并且能保護細菌自身免受其他生物體的攻擊；值得關(guān)注的是,細菌表面糖組份具有抗原性,如存在于革蘭氏陰性菌表面的脂多糖,可介導宿主細胞產(chǎn)生免疫反應。據(jù)此,細菌表面的多糖抗原成為致病菌疫苗研發(fā)的關(guān)注點。脂多糖,存在于革蘭氏陰性菌細胞表面,由脂質(zhì)A、核心寡糖及O-多糖組成；O-多糖(O-polysaccharide, O-PS),亦稱之為O-抗原,脂多糖的最外層結(jié)構(gòu),是機體免疫系統(tǒng)識別的重要靶點；O-抗原是細菌多糖疫苗研發(fā)的主要依據(jù)；同時,O-抗原具有較高的變異性,不同的菌種其O-抗原結(jié)構(gòu)不同,因此,據(jù)此研發(fā)的多糖疫苗廣譜性差。核心寡糖,連接O-抗原與脂質(zhì)A,其糖鏈結(jié)構(gòu)與O-多糖相比,在菌種之間相對保守,并具有一定的抗原性,可作為廣譜性多糖疫苗研發(fā)的候選成分。根據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)的不同,E. coli的核心寡糖分為四種類型：R1、R2、R3及K12,其中R3結(jié)構(gòu)存在于多種腸出血性大腸桿菌。值得注意的是,糖抗原疫苗所觸發(fā)宿主的免疫反應是不依賴于T細胞的,幾乎不產(chǎn)生IgG抗體以及無免疫記憶,免疫活性的持續(xù)性差,需提高糖抗原疫苗的免疫原性。細菌表面多糖除具有抗原性以外,也有其他活性表現(xiàn),例如,研究證實的大腸桿菌086：B7的O-抗原結(jié)構(gòu)與人類血型抗原B抗原結(jié)構(gòu)相似,具有B抗原活性。ABO血型系統(tǒng)是人類最重要的血型系統(tǒng)。當血型抗原A/B輸入帶有相對應血型抗體抗A/抗B人體內(nèi)時,血型抗原與相應血型抗體結(jié)合,即出現(xiàn)ABO血型不兼容(ABO-incompatible, ABOi),可導致紅細胞聚集和破裂,甚至死亡;去除血漿中抗A或B抗體可降低ABOi導致的超急性排斥反應和移植物壞死。目前,去除血型抗體常用的方法是用A/B血型抗原作為免疫吸附劑,特異性的吸附去除血型抗體。然而,血型A/B抗原的獲得方式有限,并且難固定化,這成為免疫吸附法應用的瓶頸。A/B抗原主要通過化學方法合成或酶法合成獲得�；瘜W合成步驟繁多,形成特定立體構(gòu)型糖苷鍵是難點；酶法合成,主要利用相應的糖基轉(zhuǎn)移酶催化A/B抗原合成,但糖基轉(zhuǎn)移酶來源有限,并且參與反應的活化的糖基供體價格昂貴,這些因素均限制了該方法的實際應用。因此,亟需找到一種高效、低廉的獲得A/B抗原的途徑。大腸桿菌086：B7可成為合成B抗原的細胞工廠。本論文的研究內(nèi)容分為兩部分。第一部分是大腸桿菌核心寡糖綴合物的合成及免疫學評價(第二章)；第二部分是MBPmut-OPS的合成及其吸附血型抗B抗體的應用(第三章)。第一部分：本章首先分析E. coli胞外脂多糖結(jié)構(gòu),尤其是核心寡糖R3的外核結(jié)構(gòu),R3的外核寡糖由五個單糖糖基組成,并具有分支結(jié)構(gòu),據(jù)此設計合理的化學反應方案,化學方法合成了R3外核寡糖的全五糖pentasaccharide結(jié)構(gòu)；為提高多糖抗原的免疫原性,在糖鏈還原端添加丙基氨基連接器；通過活化的連接器將pentasaccharide與載體蛋白共價連接,合成了Pentasaccharide-CRM197 (Penta-CRM197)以及Pentasaccharide-BSA (Penta-BSA)兩種糖綴合物；然后對這兩種糖綴合物進行了定性定量分析。為明確Pentasaccharide-CRM 197的免疫活性,利用小鼠進行了體內(nèi)實驗。Pentasaccharide-CRM197為免疫抗原免疫小鼠,檢測并分析其對小鼠的免疫活性。ELISA實驗檢測免疫小鼠血清抗pentasaccharide抗體滴度,結(jié)果顯示,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的特異性的抗pentasaccharide寡糖的抗體,包括IgG和IgM,這提示Penta-CRM197可很好的刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫應答,這也是評價疫苗免疫效果的重要指標之一。為進一步明確Penta-CRM197在小鼠體內(nèi)所激活的Th細胞的類型,分析了Penta-CRM197免疫小鼠所產(chǎn)生抗體IgG的亞型。小鼠體內(nèi)IgG亞型有IgG1、IgG2、IgG3等。IgG亞型各有不同的功能和特點(見表1.5),IgG亞型的不同可反應Th免疫應答的類型的不同(Thl型或Th2型)。在本實驗中,Penta-CRM197可同時刺激Thl及Th2細胞應答,其中以Th2應答為主。為驗證Penta-CRM197激活的免疫系統(tǒng)是否具有殺傷R3型致病菌的能力,本實驗選取含有R3結(jié)構(gòu)的致病菌E.coli 0157:H7作為對抗菌,進行了體外殺菌實驗；結(jié)果顯示,Penta-CRM197免疫血清對E. coli 0157:H7具有殺傷作用,免疫血清在稀釋倍數(shù)≤160時,即可達到50%的殺傷率。綜上所述,本實驗設計并合成了一種新的糖綴合物,并可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫活性。本章內(nèi)容為細菌多糖綴合物疫苗的設計及合成提供新的思路,也提示本實驗合成的Penta-CRM197作為抗E. coli R3致病菌的疫苗的潛能。第二部分：細菌胞外多糖除上述的抗原活性,尚具有其他生物學活性；值得一提的是大腸桿菌086：B7的O-抗原,其結(jié)構(gòu)與人類血型抗原B抗原結(jié)構(gòu)相似,具有B抗原活性。鑒于目前B抗原獲取的困難以及制備通用血型的迫切性,本實驗設想將大腸桿菌086：B7作為B抗原的細胞工廠,合成具有B抗原活性的O-抗原,并將其綴合在載體蛋白上,以便于分離純化。本部分中,大腸桿菌086：B7作為O-抗原合成的工廠,然而大腸桿菌086：B7不具有相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶,不能將O-抗原綴合在特定蛋白上。為此,我們將空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni, C.jejuni) N-糖基化系統(tǒng)導入大腸桿菌086：B7細胞內(nèi),該系統(tǒng)的糖基轉(zhuǎn)移酶Pg1B是合成糖蛋白綴合物的關(guān)鍵；PglB催化糖鏈從萜醇類脂載體轉(zhuǎn)移并連接在載體蛋白的天冬酰胺(N)殘基上,該天冬酰胺殘基須位于特定的氨基酸序列D/E-X-N-Y-S/T (X, Y≠P)中;在PglB的作用下,可將大腸桿菌086的O-抗原糖鏈連接于特定的載體蛋白上。本實驗選取麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose-binding protein, MBP)為O-抗原的載體蛋白,MBP由malE基因編碼,參與麥芽糖／麥芽糖糊精的轉(zhuǎn)運,與麥芽糖／麥芽糖糊精具有高親和力;在MBP肽鏈的N末端存在有引導其進入E. coli周質(zhì)空間的信號肽,因此,MBP經(jīng)常作為E. coli蛋白表達系統(tǒng)的融合標簽,阻止蛋白包涵體的形成。在構(gòu)建E. coliN-糖基化系統(tǒng)時,向E. coli導入的以上兩種基因：C. jejuni糖基轉(zhuǎn)移酶PglB的基因、MBP編碼基因malE,分別使用的載體質(zhì)粒是pACT3、pBAD24。由于MBP的氨基酸序列不存在PglB所需要的糖基化位點,因此對MBP基因malE的堿基序列進行了改造,在其表達MBP蛋白C端插入D/E-X-N-Y-S/T (X,Y≠P)_糖基化序列,將改產(chǎn)物命名為MBPmut°這樣,Pg1B可以E. coli的O-抗原為糖供體,以MBPmut為蛋白供體,催化合成具有B抗原活性的MBPmut-O-抗原綴合物。為使E. coli的O-抗原更有效的連接與載體蛋白上,本實驗通過Red重組系統(tǒng)(包括3個質(zhì)粒：pKD4、pSIM19、pCP20),成功敲除了E. coli 086的waal基因,不能表達糖基轉(zhuǎn)移酶Waal,導致E. coli 086不能將O-PS轉(zhuǎn)移并連接在Lipid A-core的糖基上,使得O-PS在E. coli周質(zhì)空間中積累,更好的為N-糖基化系統(tǒng)提供糖鏈供體。綜上所述,本實驗成功建立了E. coli N-糖基化系統(tǒng),將具有B抗原活性的O-抗原呈現(xiàn)于載體蛋白MBPmut上,成功表達了MBPmut-OPS。經(jīng)純化得到的糖綴合物,經(jīng)后續(xù)鑒定實驗包括考馬斯亮藍染色檢測、Western blot檢測、MALDI-TOF檢測結(jié)果證實是MBPmut-OPS,定量檢測得出純度達95%、純化得率約為1.5 mg/L(蛋白定量)。通過Western鑒定,純化得到的MBPmut-OPS具有人血型B抗原活性,并且,ELISA實驗驗證,MBPmut-OPS可特異性結(jié)合人抗B抗體,而沒有檢測到其與抗A抗體的相互作用；在此驗證結(jié)果的基礎(chǔ)之上,將MBPmut-OPS與人的A血型及O血型血漿相互作用,對比作用前后血漿中抗B抗體滴度,結(jié)果顯示MBPmut-OPS能夠有效的吸附血漿中的抗B抗體；并且進一步證實,該吸附作用對其凝血功能沒有影響。綜上所述,本章成功建立了E. coli O 86的N-糖基化系統(tǒng),并誘導表達純化得到了糖綴合物MBPmut-OPS;驗證了其人血型B抗原活性,然后應用該糖綴合物有效去除了人血漿中的抗B抗體。本實驗將改造的E. coli O 86作為合成具有B抗原活性糖綴合物的細胞工廠,為人血型B抗原的獲取提供新方法；為通用血型的制備以及ABOi異體移植手術(shù)抗B抗體的去除提供新的思路,具有重要的臨床意義及廣闊的應用前景。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q53

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Masaki Muramatsu;Hector Daniel Gonzalez;Roberto Cacciola;Atsushi Aikawa;Magdi M Yaqoob;Carmelo Puliatti;;ABO incompatible renal transplants:Good or bad?[J];World Journal of Transplantation;2014年01期

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本文編號：1501601