本文關(guān)鍵詞： DDX17 乙型肝炎病毒 核心啟動(dòng)子　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的HBV感染過(guò)程是病毒與宿主因子發(fā)生相互作用、相互影響的過(guò)程。在抵御病毒感染方面,一些細(xì)胞內(nèi)宿主因子具有抗病毒效應(yīng),從而對(duì)宿主免疫系統(tǒng)有補(bǔ)充作用。DEx D/H-box家族蛋白是RNA解旋酶家族中重要亞家族。有研究報(bào)道該家族中一些成員可參與抵抗病毒感染。然而關(guān)于DEx D/H-box家族蛋白在HBV復(fù)制調(diào)控中作用的報(bào)道非常有限。本研究篩選了可抑制HBV復(fù)制的DEx D/H-box家族成員,并對(duì)其中的DDX17在HBV復(fù)制調(diào)控中的作用及分子機(jī)制進(jìn)行了研究。方法1.通過(guò)NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的所有DEx D/H-box解旋酶家族蛋白種類(lèi);2.以Hep G2細(xì)胞來(lái)源c DNA為模板,利用RT-PCR方法,分別擴(kuò)增DEx D/H-box家族基因家族基因,并將目的基因片段連接至載體p CH9;3.構(gòu)建HBV核心啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因p CH9-pcore-Rluc;4.在Hep G2細(xì)胞中,分別共轉(zhuǎn)染各種目的基因表達(dá)質(zhì)粒與p CH9-pcore-Rluc或空載體與p CH9-pcore-Rluc,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶報(bào)告檢測(cè);5.使用Western blot檢測(cè)方法鑒定DDX17在Hep G2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)水平;6.使用Southern blot檢測(cè)方法鑒定過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)Hep G2細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平的影響;7.使用Western blot檢測(cè)方法鑒定DDX17在Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)水平;8.使用Southern blot檢測(cè)方法鑒定過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)Huh7細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平的影響;9.使用Northern blot檢測(cè)方法鑒定過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)Hep G2細(xì)胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響;10.使用Northern blot檢測(cè)方法鑒定過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)Huh7細(xì)胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響;11.通過(guò)ELISA方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2上清中HBe Ag分泌量的影響;12.通過(guò)ELISA方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7上清中HBe Ag分泌量的影響;13.通過(guò)ELISA方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2上清中HBs Ag分泌量的影響;14.通過(guò)ELISA方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)DDX17對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7上清中HBs Ag分泌量的影響;15.通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)DDX17對(duì)ER-α、ZAP或IFN信號(hào)途徑中節(jié)點(diǎn)分子表達(dá)水平的影響;16.構(gòu)建DDX17基序Ic和基序Ⅱ突變體A1004T+C1007G、A1077C+A1086C;17.將質(zhì)粒DDX17TPGRM、DDX17DEADM、wt DDX17或DDX17空載與HBV1.3共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,裂解細(xì)胞并進(jìn)行Southern blot檢測(cè)和Northern blot檢測(cè);18.體外轉(zhuǎn)錄HBV?莖環(huán)結(jié)構(gòu),并與過(guò)表達(dá)DDX17的細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行共孵育,進(jìn)行RNA-Protein Pull-Down實(shí)驗(yàn);19.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建DDX17基因敲除Hep G2細(xì)胞系,使用測(cè)序及Western blot方法鑒定DDX17表達(dá)是否缺失;20.在DDX17KO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)外源DDX17表達(dá)質(zhì)粒,利用Western blot檢測(cè)DDX17蛋白表達(dá)水平;21.在DDX17KO細(xì)胞中共表達(dá)DDX17空載體質(zhì)粒與HBV1.3,做Real-time PCR檢測(cè)分析和Southern blot檢測(cè);22.在DDX17KO和Hep G2細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染p CH9-pcore-Rluc和CMV-Fluc,做雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析;23.在Hep G2-DDX17KO細(xì)胞中,分別共轉(zhuǎn)染DDX17、p CH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc或者vector、p CH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc做雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)分析;24.構(gòu)建HBV核心啟動(dòng)子截短突變體;25.在Hep G2細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)上述突變體與CMV-Fluc,做雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析;26.在DDX17KO和Hep G2細(xì)胞中分別共表達(dá)p CH9-BCP-Rluc和CMV-Fluc做雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析;27.在DDX17KO和Hep G2細(xì)胞中分別共表達(dá)p CH9-1636-Rluc和CMV-Fluc、p CH9-1635/1744-Rluc和Fluc做雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析。結(jié)果1.目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人源性DEx D/H-box RNA解旋酶有58個(gè),包括16個(gè)DHX(DEAH/DEx H家族)和42個(gè)DDX(DEAD/DEx D家族);2.成功構(gòu)建27種DEx D/H-box RNA解旋酶基因真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒;3.成功構(gòu)建HBV核心啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒p CH9-pcore-Rluc;4.與對(duì)照組相比,DDX17可以顯著負(fù)向調(diào)控HBV啟動(dòng)子活性(P0.0001);5.與對(duì)照組相比,在Hep G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達(dá)質(zhì)粒后DDX17蛋白表達(dá)水平明顯升高;6.與對(duì)照組相比,在Hep G2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DDX17后HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平明顯下降;7.與對(duì)照組相比,在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達(dá)質(zhì)粒后DDX17蛋白表達(dá)水平明顯升高;8.與對(duì)照組相比,在Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DDX17后HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平明顯下降;9.與對(duì)照組相比,在Hep G2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DDX17后HBV 3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達(dá)水平均明顯下降;10.與對(duì)照組相比,在Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DDX17后HBV 3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達(dá)水平均明顯下降;11.在Hep G2細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)DDX17后HBe Ag分泌量顯著低于對(duì)照組(P=0.0032);12.在Huh7細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)DDX17后HBe Ag分泌量顯著低于對(duì)照組(P0.0001);13.在Hep G2細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)DDX17后HBs Ag分泌量顯著低于對(duì)照組(P=0.0004);14.在Huh7細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)DDX17后HBs Ag分泌量顯著低于對(duì)照組(P=0.0035);15.未發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DDX17后與對(duì)照組中ER-α、ZAP或IFN信號(hào)途徑中節(jié)點(diǎn)分子m RNA表達(dá)水平有顯著差異;16.成功構(gòu)建DDX17基序Ic和基序Ⅱ突變體TPGRM和DEADM;17.突變TPGR結(jié)構(gòu)域后,HBV DNA及HBV RNA水平明顯高于DDX17野生型對(duì)照組、而接近空載體對(duì)照組;而突變DEAD結(jié)構(gòu)域則未發(fā)現(xiàn)HBV DNA及HBV RNA與DDX17野生型對(duì)照組有明顯差異;18.HBV?莖環(huán)并不能直接與DDX17發(fā)生結(jié)合;19.成功構(gòu)建4個(gè)Hep G2-DDX17KO細(xì)胞系;20.DDX17KO細(xì)胞本身并不表達(dá)DDX17蛋白,外源DDX17表達(dá)質(zhì)粒c-Myc-DDX17可以在DDX17KO細(xì)胞中正常表達(dá);21.Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDX17KO細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3后檢測(cè)到的HBV復(fù)制中間體表達(dá)水皮顯著高于對(duì)照細(xì)胞系Hep G2(P=0.0101),Southern blot結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)DDX17KO細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3檢測(cè)到的HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平明顯高于對(duì)照細(xì)胞系Hep G2;22.與對(duì)照細(xì)胞系Hep G2相比,DDX17KO細(xì)胞中Rluc活性顯著升高(P0.0001);23.與對(duì)照組相比,DDX17KO細(xì)胞中補(bǔ)充外源DDX17后Rluc活性顯著下降(P=0.0004);24.成功構(gòu)建HBV核心啟動(dòng)子截短突變體;25.DDX17可抑制p CH9-pcore-Rluc啟動(dòng)子活性,而對(duì)截短體,無(wú)論是同時(shí)缺失Enh Ⅰ和Enh Ⅱ,或者缺失Enh Ⅰ,均表現(xiàn)為正向調(diào)控作用;Enh Ⅰ的貢獻(xiàn)率超過(guò)85%,而Enh Ⅱ僅達(dá)8.5%;并且與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)DDX17后Enh Ⅰ貢獻(xiàn)率下降11%,過(guò)表達(dá)DDX17后Enh Ⅱ及BCP貢獻(xiàn)率均有小幅度升高;26.與對(duì)照細(xì)胞系相比,DDX17KO細(xì)胞BCP啟動(dòng)子活性并無(wú)顯著差異;27.與對(duì)照細(xì)胞系相比,DDX17KO細(xì)胞中p CH9-1636-Rluc啟動(dòng)子活性顯著降低(P=0.0256),p CH9-1635/1744-Rluc啟動(dòng)子活性顯著升高(P=0.0018)。結(jié)論本研究從人源性RNA解旋酶家族入手,篩選出該家族中的DDX17在HBV復(fù)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示DDX17能使HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),DDX17可通過(guò)其RNA結(jié)合基序抑制HBV核心啟動(dòng)子及Enh Ⅰ活性,從而抑制HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of DDX17 on HBV replication in HepG 2 cells by means of Western blot . Expression of DDX17 and CMV - Fluc in DDX17KO cells were analyzed by Western blot . Compared with the control group , the levels of HBV 3.5 / 3.4 kb RNA and 2.4 / 2.1 kb RNA expression were significantly lower than those in the control group ( P = 0.0035 ) . The results showed that DDX17 inhibited the replication and transcription of HBV core promoter in DDX17KO cells .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R373.21

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本文編號(hào)：1500471