本文關(guān)鍵詞： DDX17 乙型肝炎病毒 核心啟動子　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的HBV感染過程是病毒與宿主因子發(fā)生相互作用、相互影響的過程。在抵御病毒感染方面,一些細胞內(nèi)宿主因子具有抗病毒效應(yīng),從而對宿主免疫系統(tǒng)有補充作用。DEx D/H-box家族蛋白是RNA解旋酶家族中重要亞家族。有研究報道該家族中一些成員可參與抵抗病毒感染。然而關(guān)于DEx D/H-box家族蛋白在HBV復(fù)制調(diào)控中作用的報道非常有限。本研究篩選了可抑制HBV復(fù)制的DEx D/H-box家族成員,并對其中的DDX17在HBV復(fù)制調(diào)控中的作用及分子機制進行了研究。方法1.通過NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫查詢目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的所有DEx D/H-box解旋酶家族蛋白種類;2.以Hep G2細胞來源c DNA為模板,利用RT-PCR方法,分別擴增DEx D/H-box家族基因家族基因,并將目的基因片段連接至載體p CH9;3.構(gòu)建HBV核心啟動子熒光素酶報告基因p CH9-pcore-Rluc;4.在Hep G2細胞中,分別共轉(zhuǎn)染各種目的基因表達質(zhì)粒與p CH9-pcore-Rluc或空載體與p CH9-pcore-Rluc,轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞進行熒光素酶報告檢測;5.使用Western blot檢測方法鑒定DDX17在Hep G2細胞中過表達水平;6.使用Southern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對Hep G2細胞中HBV復(fù)制中間體表達水平的影響;7.使用Western blot檢測方法鑒定DDX17在Huh7細胞中過表達水平;8.使用Southern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對Huh7細胞中HBV復(fù)制中間體表達水平的影響;9.使用Northern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對Hep G2細胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響;10.使用Northern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對Huh7細胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響;11.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞Hep G2上清中HBe Ag分泌量的影響;12.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞Huh7上清中HBe Ag分泌量的影響;13.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞Hep G2上清中HBs Ag分泌量的影響;14.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞Huh7上清中HBs Ag分泌量的影響;15.通過RT-PCR方法檢測DDX17對ER-α、ZAP或IFN信號途徑中節(jié)點分子表達水平的影響;16.構(gòu)建DDX17基序Ic和基序Ⅱ突變體A1004T+C1007G、A1077C+A1086C;17.將質(zhì)粒DDX17TPGRM、DDX17DEADM、wt DDX17或DDX17空載與HBV1.3共轉(zhuǎn)染Hep G2細胞,裂解細胞并進行Southern blot檢測和Northern blot檢測;18.體外轉(zhuǎn)錄HBV?莖環(huán)結(jié)構(gòu),并與過表達DDX17的細胞蛋白裂解液進行共孵育,進行RNA-Protein Pull-Down實驗;19.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建DDX17基因敲除Hep G2細胞系,使用測序及Western blot方法鑒定DDX17表達是否缺失;20.在DDX17KO細胞中過表達外源DDX17表達質(zhì)粒,利用Western blot檢測DDX17蛋白表達水平;21.在DDX17KO細胞中共表達DDX17空載體質(zhì)粒與HBV1.3,做Real-time PCR檢測分析和Southern blot檢測;22.在DDX17KO和Hep G2細胞中分別共轉(zhuǎn)染p CH9-pcore-Rluc和CMV-Fluc,做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析;23.在Hep G2-DDX17KO細胞中,分別共轉(zhuǎn)染DDX17、p CH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc或者vector、p CH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc做雙熒光素酶報告檢測分析;24.構(gòu)建HBV核心啟動子截短突變體;25.在Hep G2細胞中分別共轉(zhuǎn)上述突變體與CMV-Fluc,做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析;26.在DDX17KO和Hep G2細胞中分別共表達p CH9-BCP-Rluc和CMV-Fluc做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析;27.在DDX17KO和Hep G2細胞中分別共表達p CH9-1636-Rluc和CMV-Fluc、p CH9-1635/1744-Rluc和Fluc做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析。結(jié)果1.目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人源性DEx D/H-box RNA解旋酶有58個,包括16個DHX(DEAH/DEx H家族)和42個DDX(DEAD/DEx D家族);2.成功構(gòu)建27種DEx D/H-box RNA解旋酶基因真核細胞表達質(zhì)粒;3.成功構(gòu)建HBV核心啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒p CH9-pcore-Rluc;4.與對照組相比,DDX17可以顯著負向調(diào)控HBV啟動子活性(P0.0001);5.與對照組相比,在Hep G2細胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達質(zhì)粒后DDX17蛋白表達水平明顯升高;6.與對照組相比,在Hep G2細胞中過表達DDX17后HBV復(fù)制中間體表達水平明顯下降;7.與對照組相比,在Huh7細胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達質(zhì)粒后DDX17蛋白表達水平明顯升高;8.與對照組相比,在Huh7細胞中過表達DDX17后HBV復(fù)制中間體表達水平明顯下降;9.與對照組相比,在Hep G2細胞中過表達DDX17后HBV 3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達水平均明顯下降;10.與對照組相比,在Huh7細胞中過表達DDX17后HBV 3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達水平均明顯下降;11.在Hep G2細胞中,與對照組相比,過表達DDX17后HBe Ag分泌量顯著低于對照組(P=0.0032);12.在Huh7細胞中,與對照組相比,過表達DDX17后HBe Ag分泌量顯著低于對照組(P0.0001);13.在Hep G2細胞中,與對照組相比,過表達DDX17后HBs Ag分泌量顯著低于對照組(P=0.0004);14.在Huh7細胞中,與對照組相比,過表達DDX17后HBs Ag分泌量顯著低于對照組(P=0.0035);15.未發(fā)現(xiàn)過表達DDX17后與對照組中ER-α、ZAP或IFN信號途徑中節(jié)點分子m RNA表達水平有顯著差異;16.成功構(gòu)建DDX17基序Ic和基序Ⅱ突變體TPGRM和DEADM;17.突變TPGR結(jié)構(gòu)域后,HBV DNA及HBV RNA水平明顯高于DDX17野生型對照組、而接近空載體對照組;而突變DEAD結(jié)構(gòu)域則未發(fā)現(xiàn)HBV DNA及HBV RNA與DDX17野生型對照組有明顯差異;18.HBV?莖環(huán)并不能直接與DDX17發(fā)生結(jié)合;19.成功構(gòu)建4個Hep G2-DDX17KO細胞系;20.DDX17KO細胞本身并不表達DDX17蛋白,外源DDX17表達質(zhì)粒c-Myc-DDX17可以在DDX17KO細胞中正常表達;21.Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDX17KO細胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3后檢測到的HBV復(fù)制中間體表達水皮顯著高于對照細胞系Hep G2(P=0.0101),Southern blot結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)DDX17KO細胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3檢測到的HBV復(fù)制中間體表達水平明顯高于對照細胞系Hep G2;22.與對照細胞系Hep G2相比,DDX17KO細胞中Rluc活性顯著升高(P0.0001);23.與對照組相比,DDX17KO細胞中補充外源DDX17后Rluc活性顯著下降(P=0.0004);24.成功構(gòu)建HBV核心啟動子截短突變體;25.DDX17可抑制p CH9-pcore-Rluc啟動子活性,而對截短體,無論是同時缺失Enh Ⅰ和Enh Ⅱ,或者缺失Enh Ⅰ,均表現(xiàn)為正向調(diào)控作用;Enh Ⅰ的貢獻率超過85%,而Enh Ⅱ僅達8.5%;并且與對照組相比,過表達DDX17后Enh Ⅰ貢獻率下降11%,過表達DDX17后Enh Ⅱ及BCP貢獻率均有小幅度升高;26.與對照細胞系相比,DDX17KO細胞BCP啟動子活性并無顯著差異;27.與對照細胞系相比,DDX17KO細胞中p CH9-1636-Rluc啟動子活性顯著降低(P=0.0256),p CH9-1635/1744-Rluc啟動子活性顯著升高(P=0.0018)。結(jié)論本研究從人源性RNA解旋酶家族入手,篩選出該家族中的DDX17在HBV復(fù)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示DDX17能使HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),DDX17可通過其RNA結(jié)合基序抑制HBV核心啟動子及Enh Ⅰ活性,從而抑制HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of DDX17 on HBV replication in HepG 2 cells by means of Western blot . Expression of DDX17 and CMV - Fluc in DDX17KO cells were analyzed by Western blot . Compared with the control group , the levels of HBV 3.5 / 3.4 kb RNA and 2.4 / 2.1 kb RNA expression were significantly lower than those in the control group ( P = 0.0035 ) . The results showed that DDX17 inhibited the replication and transcription of HBV core promoter in DDX17KO cells .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373.21

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李明，，陸長德;真核蛋白編碼基因核心啟動子結(jié)構(gòu)研究進展[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1995年04期

2 張忠東;成軍;鐘彥偉;楊倩;董菁;楊艷杰;張樹林;;羧肽酶N調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒核心啟動子表達活性的研究[J];世界華人消化雜志;2003年08期

3 侯婧逸;李華;康亞妮;孫潔林;;裂殖酵母核心啟動子結(jié)構(gòu)的初步研究[J];核技術(shù);2013年03期

4 彭R

本文編號：1500471