本文關(guān)鍵詞： 玉米 ZmUBP家族蛋白 蛋白質(zhì)互作 非生物脅迫應(yīng)答 分子進(jìn)化　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：玉米是我國(guó)種植面積最大的糧食作物。生物與非生物逆境脅迫嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì),抗逆育種已成為玉米遺傳改良的重要方向,因此發(fā)掘和研究抗逆相關(guān)基因及其功能并進(jìn)行分子育種,是培育抗逆新品種提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的一種有效途徑。泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-Specific Protease,UBP)是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中的保守性很高的蛋白,它們通過(guò)脫泛素化作用調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育。在植物抗逆過(guò)程中,UBP蛋白也有著重要的作用,但迄今關(guān)于玉米中該蛋白基因家族的功能還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)玉米基因組ZmUBP家族分析,克隆了玉米中UBP14, ZmUBP16a,ZmUBP16b和zmUBP16c,并對(duì)這些基因的功能進(jìn)行了分析鑒定；同時(shí)對(duì)玉米及其他禾本科物種中抗逆相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了分子進(jìn)化的研究。獲得了以下主要結(jié)果：1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明,ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c均含有UBP結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)模式分析顯示,它們?cè)谟衩咨L(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都普遍表達(dá)。不同的非生物脅迫處理下,ZmUBP16a,ZmUBP16b和ZmUBP16c能夠響應(yīng)脫落酸誘導(dǎo)、鹽離子及重金屬脅迫。通過(guò)構(gòu)建ZmUBP14-GFP和ZmUBP16a/b/c-GFP載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,研究ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c的蛋白定位,結(jié)果表明ZmUBP14-GFP融合蛋白定位在細(xì)胞核中,ZmUBP 16a-GFP,ZmUBP 16b-GFP和ZmUBP16c-GFP融合蛋白均定位在細(xì)胞膜上。2、通過(guò)構(gòu)建ZmUBP16a,ZmUBPl6b和ZmUBP16c過(guò)表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化擬南芥ubp16功能缺失突變體,結(jié)果顯示,這三個(gè)蛋白均能回補(bǔ)擬南芥ubp16功能缺失突變體的表型。在擬南芥中分別過(guò)表達(dá)玉米ZmUBP16a,zmUBPl6b和zmUBP16c,分析表明,ZmUBP16a,ZmUBP16b和zmUBP16c的過(guò)表達(dá)并不影響植株的抗鹽性,在經(jīng)100mM NaCl處理后,過(guò)表達(dá)植株的表型與空載體對(duì)照無(wú)明顯差異；在0.5μM ABA的處理下,過(guò)表達(dá)植株的發(fā)芽率在比空載體對(duì)照低了約50%,過(guò)表達(dá)ZmUBP16a和ZmUBP16b的植株表現(xiàn)出對(duì)CdCl2明顯的不敏感性;因此說(shuō)明,過(guò)表達(dá)ZmUBPl6a,ZmUBPl6b和zmUBP16c能夠提高了擬南芥對(duì)ABA的敏感性和對(duì)重金屬的抗性。3、通過(guò)對(duì)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)逆境條件下,zmUBP16a, ZmUBP16b和ZmUBP16c過(guò)表達(dá)植株中的抗逆功能基因的表達(dá)水平顯著提高,抗重金屬相關(guān)基因如AtABCC1,AtABCC2和AtPCS在鎘處理后表達(dá)量明顯高于對(duì)照；ABA通路基因以及與ABA合成相關(guān)基因(如AtNCED3,AtMYB2,AtRD22)的表達(dá)量也明顯高于對(duì)照植株,而不依賴(lài)于ABA的抗逆基因AtCBF表達(dá)量變化不大。結(jié)果表明,ZmUBP16α,ZmUBP16b和ZmUBP16c是通過(guò)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與離子脅迫應(yīng)答。4、為進(jìn)一步確認(rèn)ZmUBP16a在重金屬脅迫下的作用機(jī)制,本研究選取了野生型以及ZmUBP16a過(guò)表達(dá)植株在金屬鎘處理前后的植株樣品,進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過(guò)表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn),zmUBP16a過(guò)表達(dá)引起的上調(diào)基因中,大部分為代謝相關(guān)基因,包括糖代謝、能量代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝,在重金屬鎘處理后,這些代謝相關(guān)基因在過(guò)表達(dá)和野生型植株中大多呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。在過(guò)表達(dá)和重金屬處理都能引起上調(diào)表達(dá)的有3個(gè)功能基因,其中AT1G05680是活性氧(ROS)和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要的作用的基因。5、通過(guò)構(gòu)建ZmUBPl4過(guò)表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化擬南芥ubp14功能缺失突變體。分析結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)玉米ZmUBP14基因能夠回補(bǔ)擬南芥ubp14功能缺失突變體的表型。利用Pull-down分析技術(shù),發(fā)現(xiàn)ZmUBP14和玉米抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZmTCP15a以及ZmTCP15b在體外存在互作；雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)分析也表明,ZmUBP14分別和ZmTCP15a/b)在植物體內(nèi)也存在互作關(guān)系。因此ZmUBP14可能是與ZmTCP15家族蛋白互作,在逆境應(yīng)激反應(yīng)的功能上協(xié)同發(fā)揮作用。6、在禾本科物種中,重要的抗逆基因家族WRKY轉(zhuǎn)錄因子第一亞家族的基因在染色體上呈現(xiàn)出串聯(lián)復(fù)制,并存在著廣泛的微共線性關(guān)系,54個(gè)包含WRKYI基因的37個(gè)區(qū)段一共可以組裝成8個(gè)具有共線性的區(qū)段組；除此之外,選擇壓力分析表明,禾本科家族中WRKYI基因的進(jìn)化歷程中,純化選擇起主導(dǎo)作用。
[Abstract]:Maize is the largest crop planting area in China. Seriously affect the yield and quality of Maize to biotic and abiotic stress resistance breeding has become an important direction for maize genetic improvement. Therefore, explore and study the resistance related genes and molecular breeding, breeding new resistant varieties is an effective way to improve the yield of and the quality of maize. Ubiquitin specific protease (Ubiquitin-Specific, Protease, UBP) are widely distributed in eukaryotes is highly conservative protein de ubiquitination through the regulation of growth and development. In the process of plant stress, UBP protein also plays an important role, but so far on the protein gene corn in family function has not been reported. In this study, through the analysis of the maize genome was cloned in Maize ZmUBP family, UBP14, ZmUBP16a, ZmUBP16b and zmUBP16c, and the gene function Can be analyzed and identified; the corn and other gramineous species against the WRKY family of transcription factors related to molecular evolution were studied. The main results were as follows: 1, protein domain analysis showed that ZmUBP14 and ZmUBP16a/b/c contain UBP domain. Analysis showed that the expression pattern, they are in various stages of maize the growth of common expression. Different abiotic stress treatments, ZmUBP16a, ZmUBP16b and ZmUBP16c can response induced by abscisic acid, salt and heavy metal stress. Based on the ZmUBP14-GFP and ZmUBP16a/b/c-GFP vector and transformed into Arabidopsis thaliana, protein localization of ZmUBP14 and ZmUBP16a/b/c, the results showed that ZmUBP14-GFP fusion protein located in the nucleus, ZmUBP 16a-GFP, ZmUBP 16b-GFP and ZmUBP16c-GFP fusion proteins were localized in the cell membrane of.2, ZmUBPl6b and ZmUBP16c through the construction of ZmUBP16a expression vector The loss of function of ubp16, were transformed into Arabidopsis mutants. The results show that the three phenotypic protein were recovered in Arabidopsis ubp16 deficient mutants. In Arabidopsis thaliana were over expression of maize ZmUBP16a, zmUBPl6b and zmUBP16c analysis showed that ZmUBP16a overexpression of ZmUBP16b and zmUBP16c did not affect plant salt tolerance in 100mM NaCl after treatment, overexpression phenotype and empty vector control plants had no significant difference; in the treatment of 0.5 M ABA, the germination rate of overexpression plants than in the empty vector control is down about 50%, over expression of ZmUBP16a and ZmUBP16b plants showed obvious sensitivity to CdCl2; therefore, over expression of ZmUBPl6a. ZmUBPl6b and zmUBP16c can improve the sensitivity of Arabidopsis ABA and heavy metal resistance of.3, the expression of related genes against inverse analysis, found that under stress conditions, zmUBP16a, ZmUBP16b and ZmUBP16c. The expression level of expression in plant resistance genes significantly increased resistance to heavy metal related genes such as AtABCC1, the expression of AtABCC2 and AtPCS in cadmium treated were higher than that of the control; ABA pathway and ABA synthesis related genes (such as AtNCED3, AtMYB2, AtRD22) expression was significantly higher than that of control plants, but does not depend on ABA resistance gene AtCBF expression did not change. The results show that the ZmUBP16b and ZmUBP16 alpha, ZmUBP16c is through the ABA signaling pathway in response to.4 stress, to further confirm the role of ZmUBP16a in heavy metal stress mechanism, this study selected the wild type and ZmUBP16a overexpressing plants in plant samples before and after cadmium treatment, high throughput transcriptome sequencing, the expression analysis found that overexpression of zmUBP16a up-regulated genes induced in the majority of metabolism related genes, including glucose metabolism, energy generation Xie, fatty acid metabolism, amino acid metabolism and nucleotide metabolism in cadmium treated, these metabolic genes are down regulated in expression and in wild type plants. It can up regulate the expression of the expression and treatment of heavy metals has 3 functional genes, where AT1G05680 is the active oxygen (ROS) gene.5 and an important role in plant hormone signal transduction pathway, through the construction of ZmUBPl4 expression vector and transformed into Arabidopsis ubp14 deficient mutant. The analysis results show that the over expression of ZmUBP14 gene in maize can recharge phenotype of Arabidopsis ubp14 deficient mutant. By using Pull-down analysis technology, ZmUBP14 and maize transcription factor ZmTCP15a and ZmTCP15b in vitro interaction; bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technology analysis also shows that ZmUBP14 and ZmTCP15a/b respectively) are also close interaction in plants Therefore. ZmUBP14 may be the interaction with the ZmTCP15 protein family, in adversity stress response function on the synergistic effect of.6, in the Poaceae species, important resistance gene WRKY family transcription factor subfamily I gene on a chromosome showing a tandem duplication, and the existence of microcolinearity is wide, 37 section 54 contains the WRKYI gene can be assembled into a total of 8 sections were with linear; in addition, the selection pressure analysis shows that the evolution of the WRKYI gene in the family Poaceae, purifying selection plays a leading role.

【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：1499391