本文關(guān)鍵詞： 單細(xì)胞分析 細(xì)胞微環(huán)境 高通量分析 瓊脂糖芯片 表面潤濕性芯片　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著人類基因組計(jì)劃的完成,生命科學(xué)進(jìn)入了后基因組時(shí)代,為了進(jìn)一步揭開生命的奧秘,所需的生物信息規(guī)�？涨暗谋ā＝⑿乱淮咄康纳锓治黾夹g(shù)是當(dāng)今許多研究領(lǐng)域的迫切需求。建立高通量的生物信息獲取技術(shù)將廣泛應(yīng)用于基因組學(xué),蛋白組學(xué),藥物篩選,干細(xì)胞分化等諸多領(lǐng)域。然而生物信息的高通量獲取依然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn),其挑戰(zhàn)主要來自兩方面：一方面是如何更精準(zhǔn)地獲取生物學(xué)信息,如單細(xì)胞信息；另一方面是如何從更為真實(shí)的復(fù)雜生物微環(huán)境中高通量地獲取生物學(xué)信息。傳統(tǒng)的高通量分析方法主要是基于流式細(xì)胞,微孔板檢測器和點(diǎn)樣儀。其局限性在于無法準(zhǔn)確的記錄單細(xì)胞的動態(tài)響應(yīng),并且不能重建復(fù)雜三維的細(xì)胞微環(huán)境。近年來,微流控芯片由于其精確可控,高通量,尺度與細(xì)胞組織相匹配等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注。同時(shí)基于微流控芯片的高通量分析呈現(xiàn)多元化發(fā)展,以滿足不同領(lǐng)域的需求。本文針對單細(xì)胞和復(fù)雜生物微環(huán)境的高通量分析,建立了基于瓊脂糖水凝膠、表面潤濕性圖案化和PDMS微通道的三類微流控芯片。主要研究結(jié)果如下：(1)建立一種基于瓊脂糖微流控芯片的高通量單細(xì)胞基因組損傷分析方法。該方法可以在一塊芯片上同時(shí)檢測多至10000個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞基因組損傷,在保證更好的重現(xiàn)性的前提下,通量上相比傳統(tǒng)方法提高了一百倍。通過采用瓊脂糖作為微流控芯片的加工材質(zhì),利用瓊脂糖的超親水特性自動進(jìn)樣細(xì)胞并在通道內(nèi)自動排列形成單細(xì)胞陣列。隨即包埋細(xì)胞于瓊脂糖微流體芯片中,并裂解電泳,分離并檢測損傷DNA。該方法同樣可以用于單細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的研究,可廣泛應(yīng)用于藥物篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域。(2)建立一種自定義濃度梯度芯片用于高通量單細(xì)胞多藥耐藥性分析。該芯片所形成的濃度梯度由分配通道長短比例決定,與液體流速和驅(qū)動壓力無關(guān),該設(shè)計(jì)保證了濃度梯度形成的穩(wěn)定性并簡化了芯片設(shè)計(jì)易于集成化。該芯片可以在單細(xì)胞乃至單細(xì)胞器水平分析數(shù)百個(gè)的細(xì)胞的多藥耐藥性,可以實(shí)時(shí)監(jiān)控單細(xì)胞的藥物外流。更進(jìn)一步的,該方法可以用于化療增強(qiáng)劑的高通量篩選。(3)建立一種低成本,快速且便攜化的細(xì)菌富集和檢測裝置。該芯片由瓊脂糖材質(zhì)加工而成,利用瓊脂糖材質(zhì)的超親水性和水滲透性,自動進(jìn)樣細(xì)菌懸液于微通道中,由于該芯片通道末端封閉設(shè)計(jì),細(xì)菌被富集收集于通道末端。該芯片最多可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌樣品一千萬倍的富集。在一百萬倍富集的條件下,其細(xì)菌捕獲效率高達(dá)90%以上。該方法被證實(shí)同樣可以用于血液樣品和尿液樣品的富集檢測。通過結(jié)合免疫熒光染色,該方法成功檢測到了臨床病人樣品中感染的細(xì)菌。(4)建立基于三維梯形微流體通道的細(xì)胞密度梯度組裝新方法,通過控制微流體通道不同區(qū)域范圍內(nèi)通道高度,在均一的細(xì)胞懸液通入微流體通道后,待細(xì)胞隨重力沉降,便能形成細(xì)胞密度梯度。通過該方法組裝細(xì)胞密度梯度可在10分鐘內(nèi)完成。基于該方法通過順序組裝可以組裝成多細(xì)胞種類細(xì)胞密度梯度。通過改變?nèi)S微流體通道中單層通道的形狀可以控制細(xì)胞密度梯度的圖案化。該組裝方法可以模擬真實(shí)組織中的細(xì)胞密度梯度,重建其細(xì)胞間相互作用。該細(xì)胞模型可以用于高通量研究該復(fù)雜細(xì)胞微環(huán)境下細(xì)胞的行為和功能,我們研究發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞密度下對碲化鎘量子點(diǎn)毒性的耐受性有不同的表現(xiàn)。(5)基于表面潤濕性的異質(zhì)性復(fù)雜生物微環(huán)境高通量組裝平臺,我們進(jìn)一步提出了一種可以同時(shí)高通量組裝數(shù)以千計(jì)異質(zhì)性生物微環(huán)境的方法。采用該表面潤濕性圖案化芯片,最多可以在數(shù)秒內(nèi)同時(shí)加工百萬計(jì)的單一組分液滴/微凝膠陣列。通過對單一組分液滴陣列融合與分裂等操作,可以在10分鐘內(nèi)組裝數(shù)以千記的異質(zhì)性細(xì)胞微環(huán)境陣列。該方法可以精確控制陣列中每一個(gè)細(xì)胞微環(huán)境陣列中的物理信號(包括圖案化,材料的機(jī)械性能等),材料組成,化學(xué)信號(化學(xué)濃度,和多組分化學(xué)因子空間分布)以及細(xì)胞間相互作用(細(xì)胞密度梯度以及多細(xì)胞種類空間分布與相互作用)。該方法可以做為一種高通量分析平臺,廣泛用于組織工程,藥物篩選和干細(xì)胞研究等領(lǐng)域。(6)基于表面潤濕性的異質(zhì)性復(fù)雜土壤-微生物微環(huán)境高通量組裝平臺,我們將其命名為芯片微地球。采用該表面潤濕性圖案化芯片,最多可以在數(shù)秒內(nèi)同時(shí)加工數(shù)萬計(jì)的單一組分土壤微環(huán)境。也可以通過結(jié)合點(diǎn)樣,在十分鐘內(nèi)加工幾百個(gè)異質(zhì)性的土壤異質(zhì)性微環(huán)境陣列。我們可以精確控制土壤微環(huán)境中的圖案化,土壤礦物質(zhì)成分,土壤有機(jī)質(zhì)含量和成分,土壤微生物菌落等。通過微流體芯片,可以精確控制土壤周圍的化學(xué)微環(huán)境,其中包括離子強(qiáng)度,酸堿度等因素。我們接著在該土壤芯片模型上研究了土壤的動態(tài)組裝過程,我們觀察到均一性的土壤懸液在組裝過程中,土壤有機(jī)質(zhì)和細(xì)菌會組裝至土壤微生物復(fù)合物的邊緣和角落。其現(xiàn)象原理同咖啡圈效應(yīng),且該組裝中的異質(zhì)性分布與其土壤的礦物組成成分之間有著一定的規(guī)律。該芯片模型模擬的現(xiàn)象重建了真實(shí)土壤形成過程中組分異質(zhì)性分布的過程,并證明了物理作用可以影響土壤異質(zhì)性分布。接著我們利用該系統(tǒng)研究了土壤對微生物生長行為的影響,我們發(fā)現(xiàn)微生物的吸附生長在一定程度上與其土壤復(fù)合物的拓?fù)鋱D案化有關(guān),其細(xì)胞活性與土壤礦物組成成分有關(guān)。最后我們通過結(jié)合該方法與XPS技術(shù),研究微生物對土壤的作用,發(fā)現(xiàn)微生物的代謝調(diào)節(jié)著微生物-土壤微環(huán)境中的碳氮循環(huán)。綜上所述：本文提出了一種瓊脂糖微流控芯片,該裝置在無需外力驅(qū)動設(shè)備控制下,可自動組裝單細(xì)胞陣列用于高通量單細(xì)胞基因組損傷分析,并擴(kuò)展應(yīng)用于細(xì)菌的富集和檢測；本文建立了一種基于表面潤濕性的微液滴芯片,該裝置可以高通量地在數(shù)分鐘內(nèi)精確組裝數(shù)千個(gè)多組分陣列化的異質(zhì)性三維細(xì)胞微環(huán)境,并擴(kuò)展應(yīng)用于土壤微環(huán)境的精確組裝與高通量分析；本文發(fā)展了基于PDMS通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片,該類芯片可以自定義地可控形成化學(xué)濃度梯度和細(xì)胞密度梯度,該類芯片首次實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞密度梯度的圖案化,被應(yīng)用于單細(xì)胞藥物外流動態(tài)過程的監(jiān)控,化療增強(qiáng)劑的篩選,和納米材料的細(xì)胞毒性分析。本文的研究為高通量生物分析提供了更多可靠的平臺技術(shù)。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q81
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本文編號：1491674