本文關(guān)鍵詞： 組蛋白H2B單泛素化 微管 酪氨酸磷酸化 MAPK 鹽脅迫 擬南芥　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：植物在生長發(fā)育過程中受到各種生物和非生物脅迫的影響。鹽脅迫作為一種重要的非生物脅迫,是影響和制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素。植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完整的調(diào)控機(jī)制來適應(yīng)環(huán)境脅迫。研究表明,組蛋白H2B單泛素化(Histone H2B monoubiquitination,H2Bub 1)參與調(diào)控植物體內(nèi)多個(gè)發(fā)育過程以及對生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng),但目前關(guān)于H2Bub1參與植物抗非生物脅迫的研究還未見報(bào)道。本論文選用擬南芥野生型和H2Bub1功能缺失突變體hub1-4,hub2-2,hub1-4hub2-2,對H2Bub1在擬南芥響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下,H2Bub1功能缺失突變體表現(xiàn)出葉片失綠、根生長受到抑制和存活率下降等鹽敏感表型;NaCl處理引起野生型中H2Bub1基因HUB1(Histone monoubiuitination 1)和HUB2的轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生不同程度的上調(diào)。表明,H2Bub1正調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察鹽脅迫下的微管骨架動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)H2Bub1功能缺失使微管解聚速度變慢,微管解聚程度減弱,證明H2Bub1調(diào)控鹽脅迫反應(yīng)中微管骨架的解聚過程。對H2Bub1調(diào)控鹽脅迫反應(yīng)中微管解聚的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。通過Rea1-time PCR的方法定量分析基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下H2Bub1的功能缺失抑制了酪氨酸磷酸酶基因PTP1(Protein Tyrosine Phosphatase 1),DsPTP1(Dual-Specificity Protein Tyrosine Phosphatase 1),MKP1(MAP Kinase Phosphatase 1),MKP2(MAP Kinase Phosphatase 2),IBR5(Indole-3-Butyric Acid Response 5)和PHS1(Propyzamide Hypersensitive 1)的表達(dá),由此表明,鹽脅迫中H2Bub1是酪氨酸磷酸酶基因的正調(diào)控因子。利用35S:PTP1/hub1-4和35S:MKP1/hub1-4株系觀察到hub1-4突變體的鹽敏感表型得到回復(fù),微管動(dòng)態(tài)分析也證明hub1-4突變體的微管解聚回復(fù)到與野生型相似。表明,PTP1和MKP1調(diào)控?cái)M南芥抗鹽脅迫反應(yīng)中微管的解聚過程。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明,PTP1,MKP1與MPK3(Mitogen-Activated Protein Kinase 3),MPK6互作,且PTP1,MKP1調(diào)控MPK3和MPK6的活性。隨后對鹽脅迫下野生型和H2Bub1突變體中MPK3和MPK6的基因表達(dá)、蛋白水平和激酶活性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)H2Bub1影響擬南芥對鹽脅迫響應(yīng)中MPK3和MPK6的活性。利用MPK3和MPK6的持續(xù)激活突變體MKK5DD進(jìn)行鹽敏感表型和微管動(dòng)態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)MKK5DD突變體更抗鹽脅迫且微管解聚速度明顯快于野生型,表明MPK3和MPK6的激活加快微管的解聚過程,進(jìn)而影響擬南芥的抗鹽脅迫能力。同時(shí),通過藥理學(xué)方法檢測酪氨酸磷酸化對野生型和H2Bub1缺失突變體微管骨架的影響,結(jié)果顯示,鹽脅迫中,附加酪氨酸激酶抑制劑GN(genistein)可促使微管穩(wěn)定,植株表現(xiàn)出鹽敏感的表型,野生型表現(xiàn)更為明顯;附加酪氨酸磷酸抑制劑PAO(phenylarsine oxide)可促使微管解聚,植株表現(xiàn)出更耐鹽的表型,H2Bub1缺失突變體表現(xiàn)更為明顯。進(jìn)一步驗(yàn)證了酪氨酸磷酸化參與H2Bub1調(diào)控?cái)M南芥鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中微管的解聚過程。微管骨架的結(jié)構(gòu)和功能依賴于微管結(jié)合蛋白,其中,MAP65-1(Microtubule-Associated Protein 65-1)是研究較為深入的微管結(jié)合蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)M4P65-1影響擬南芥抗鹽脅迫反應(yīng)中微管的解聚,更重要的是,參與調(diào)控隨后的微管聚合過程。且熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MPK3,MPK6可能與MAP65-1互作。綜上結(jié)果,H2Bub1調(diào)控?cái)M南芥對鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中微管的解聚。H2Bub1可能通過PTP(Protein Tyrosine Phosphatase)-MPK3/6的信號(hào)模式調(diào)控微管結(jié)合蛋白的磷酸化與去磷酸化,從而調(diào)控微管骨架的解聚,而快速的微管解聚對植物適應(yīng)鹽脅迫至關(guān)重要。本研究為闡明植物抗鹽脅迫的分子機(jī)理提供新的理論依據(jù),也補(bǔ)充了植物中H2Bub1抵抗非生物脅迫作用的研究空缺。
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本文編號(hào)：1491422