本文關(guān)鍵詞： 三唑錫 斑馬魚 性腺軸 類固醇激素 內(nèi)分泌干擾 生殖毒性　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：農(nóng)藥作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要投入物資,對人類糧食供給做出了巨大貢獻(xiàn)。然而由于農(nóng)藥的長期大量使用,其對生物多樣性也產(chǎn)生了嚴(yán)重的破壞,對人類健康及內(nèi)分泌干擾存在著潛在的威脅。即使環(huán)境和食品中微量的農(nóng)藥殘留也可能對人體產(chǎn)生影響,干擾內(nèi)分泌機(jī)能,引起性激素失常以及生殖障礙等,因此農(nóng)藥引起的內(nèi)分泌干擾已成為全球性的一個重大問題。故此,本論文研究了我國當(dāng)前廣泛使用的殺菌劑三唑酮、除草劑莠去津以及殺螨劑三唑錫對斑馬魚性激素干擾及生物標(biāo)志物基因的變化效應(yīng),繼而進(jìn)一步研究三唑錫對斑馬魚的生殖毒性,類固醇激素的干擾效應(yīng)以及相關(guān)功能基因的調(diào)控作用,探討了其可能的分子機(jī)制。研究結(jié)果主要包括以下幾個方面：1、以三唑酮、莠去津和三唑錫為試驗研究對象,雌性斑馬魚成魚暴露21天,監(jiān)測與抗雌激素效應(yīng)有直接因果關(guān)系的效應(yīng)生物標(biāo)志物era,vtg基因,以及激素雌二醇(E2)的變化為終點(diǎn)指標(biāo)研究了對斑馬魚性激素干擾作用。結(jié)果表明：雌性斑馬魚暴露于0.45μg/L三唑錫中,體內(nèi)E2顯著下降,使得雌激素應(yīng)答基因(era, vtgl)表達(dá)量顯著下降,顯示出明顯的抗雌激素效應(yīng)。2、參照OECD 229試驗方法,用0.09μg/L,0.45μg/L三唑錫暴露成熟期斑馬魚21天,檢查了對斑馬魚繁殖的影響,同時取性腺進(jìn)行了組織切片的觀察。結(jié)果表明：斑馬魚平均產(chǎn)卵量隨著三唑錫暴露濃度的增加而顯著降低；0.09μg/L和0.45μg/L處理組均可引起斑馬魚雌性成魚的性腺指數(shù)顯著降低,但并未引起雄性成魚性腺指數(shù)的顯著變化；卵巢組織損傷主要表現(xiàn)為初級卵母細(xì)胞(PO)百分比和閉鎖細(xì)胞(AO)百分比顯著增加,而成熟卵母細(xì)胞(LMO)百分比顯著減少；精巢組織損傷主要表現(xiàn)為精母細(xì)胞(Sc)的百分比顯著增加,而精子細(xì)胞(Sz)的百分比顯著減少。表明三唑錫染毒暴露能夠影響正常的產(chǎn)卵并產(chǎn)生一定程度的生殖毒性。此外,性腺中三唑錫的積累也可能導(dǎo)致排卵障礙,進(jìn)而影響配子形成；同時在斑馬魚魚卵中檢測到積累性的三唑錫,證明三唑錫可經(jīng)親代(FO)暴露、在性腺中積累而傳遞給子代(F1),而F1代孵化的畸形率隨著三唑錫暴露濃度的增加而顯著增加,表明親代暴露于三唑錫可引起子代發(fā)育的毒性效應(yīng)。3、采用UPLC-MS/MS技術(shù),對斑馬魚性激素合成途徑中涉及到的13種激素進(jìn)行定量測定,并對性激素代謝物進(jìn)行了初步的鑒定。結(jié)果表明：三唑錫染毒暴露處理能夠抑制斑馬魚體內(nèi)促黃體激素(LH)的分泌,進(jìn)而抑制了雌激素的合成,導(dǎo)致雄激素水平相應(yīng)升高。同時,三唑錫還可以通過抑制性腺中促性腺細(xì)胞成熟的前體激素17P4的合成,干擾了體內(nèi)脅迫激素。通過對肝臟中雌激素代謝物的分析鑒定,發(fā)現(xiàn)雌激素甲基化修飾物,表明三唑錫可促進(jìn)斑馬魚體內(nèi)雌激素的代謝速率。4、采用Rt-PCR技術(shù),對斑馬魚性腺軸(HPG)參與類固醇激素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等相關(guān)基因進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：(1)0.45 μg/L三唑錫、100 μg/L法倔唑的暴露處理,可顯著下調(diào)斑馬魚腦中促黃體激素(lhβ)基因的表達(dá)；法倔唑暴露處理組顯著下調(diào)斑馬魚腦中細(xì)胞色素P450酶系cyp19a1b基因的表達(dá)；(2)0.45μg/L三唑錫暴露處理可顯著上調(diào)斑馬魚性腺中3p-甾體羥基脫氫酶(3/3-hsd),17β-甾體羥基脫氫酶3(17(17β-hsd3)基因的表達(dá)；100μg/L法倔唑暴露處理可顯著上調(diào)斑馬魚性腺中細(xì)胞色素P450酶系cyp17和17p-甾體羥基脫氫酶1 (17β-hsdl)基因的表達(dá)。三唑錫對雌性斑馬魚暴露處理的低劑量組可抑制卵巢芳香化酶(cyp19a1a)基因的表達(dá),而高劑量組卻促進(jìn)了芳香化酶基因的表達(dá)；對雄性斑馬魚顯示了三唑錫均顯著抑制精巢cyp19a1a基因的表達(dá)；(3)斑馬魚肝臟中雌激素受體(era)基因的表達(dá)在所有暴露處理組中均顯著下調(diào)。0.45μg/L三唑錫和100 μg/L法倔唑暴露處理組顯著下調(diào)了斑馬魚肝臟中卵黃蛋白原1(vtg1)和卵黃蛋白原2(vtg2)基因的表達(dá)；但在三唑錫暴露處理組中細(xì)胞色素P450酶系(cyp1al),兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(comt),葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(ugt1a)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(gstp1)代謝相關(guān)基因的表達(dá)均顯著上調(diào),而芳香烴受體(ahr2)在雌魚肝臟中表達(dá)顯著下調(diào)；100μg/L法倔唑暴露處理組可顯著上調(diào)斑馬魚肝臟中comt和gstp1基因的表達(dá),在雌魚暴露處理組可顯著上調(diào)ahr2、 cyplal和ugt1a基因的表達(dá),但在雄魚肝臟中的表達(dá)量卻沒有變化；5、采用主成分分析法,評估了所測基因的基因表達(dá)和性激素含量以及繁殖的相關(guān)性。結(jié)果表明：雌魚中,PC1主要受到fshfβ, Ihβ, cypl9ala,17β-hsd3, vtgl, ugtla和gstp1基因的影響,并且和T,E2,E1,AE,P4,17P4等6個類固醇激素以及繁殖力顯著相關(guān)；雄魚中,PC1主要受到Ihβ，，fshβ, cypl9ala, star,17β-hsd3, era, cyplal, ugtla和gstp1基因的影響,并且和11-KT和E2兩個類固醇激素顯著相關(guān)。通過上述試驗研究,結(jié)果表明三唑錫對斑馬魚性腺發(fā)育及繁殖具有明顯的抑制作用,并對類固醇激素合成、轉(zhuǎn)化和代謝通路產(chǎn)生明顯干擾作用,表現(xiàn)出斑馬魚性腺軸相關(guān)基因調(diào)控所對應(yīng)的抗雌激素效應(yīng),其分子機(jī)制主要通過以下途徑表現(xiàn)出斑馬魚生殖內(nèi)分泌干擾作用：(1)三唑錫可能通過阻止E2與受體er的結(jié)合,導(dǎo)致雌魚體內(nèi)E2水平的降低和肝臟vtg表達(dá)下調(diào)；(2)三唑錫可能通過對斑馬魚類固醇激素P4合成,以及P4轉(zhuǎn)化為DHEA、AE、T和11-KT過程中的相關(guān)催化酶3β-hsd、cyp17和17β-hsd3的激活效應(yīng),導(dǎo)致了體內(nèi)雄性激素水平的上升和積累,表現(xiàn)出與E2下降、vtg基因表達(dá)下調(diào)相同的效應(yīng),即抗雌激素干擾效應(yīng)；(3)由于三唑錫對斑馬魚肝臟的氧化脅迫和甲基化作用影響,促使活性氧自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化過程誘導(dǎo)了ugtla和gstp1基因表達(dá)的上調(diào),加速了體內(nèi)類固醇激素的羥基化和甲基化代謝過程；(4)lhβ基因表達(dá)的下調(diào)可導(dǎo)致血清中促黃體激素濃度的降低,而延遲了精子細(xì)胞和卵母細(xì)胞的成熟；而E2水平的下降對雌魚性腺發(fā)育具有明顯的抑制作用。性腺切片證實(shí)E2水平下調(diào)導(dǎo)致了生殖損傷的產(chǎn)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X171.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1484489