本文關(guān)鍵詞：酵母端粒酶延伸端粒DNA分子機制的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶 RNA亞基 Pif1解旋酶 外切酶

【摘要】：端粒酶是由一種蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和一個RNA亞基(TR)組成的,是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)來維持真核細胞染色體兩端的端粒重復序列添加串聯(lián)。端粒酶一個典型的特點區(qū)別于其他的逆轉(zhuǎn)錄酶RT是其精確和重復復制指定區(qū)域的RNA亞基的能力。以前的研究已經(jīng)表明,RNA模板上游的某個不固定區(qū)域決定著模板的邊界。在這項研究中我們利用高度純度化的假絲酵母TERT與端粒RNA在體外重新組裝成有功能的大分子復合體。令人驚訝的是我們發(fā)現(xiàn)這個重組端粒酶顯示出幾個意想不到的性質(zhì)。首先作為一種有逆轉(zhuǎn)錄功能的酶只需要端粒RNA模板區(qū)域,它不需要端粒RNA其它二級結(jié)構(gòu)和序列的支持。第二,DNA合成受到鑲嵌在端粒RNA模板區(qū)兩個固定核酸的調(diào)控,即延伸信號停止在rC~(261)-rC~(262)兩個核苷酸之前。第三,一旦端粒DNA的延伸超過rC~(261)-rC~(262)兩個核苷酸,會啟動一個打開RNA徑環(huán)的過程。最后更令我們驚訝的是假絲酵母TERT能夠用非TER-RNA模板來調(diào)節(jié)非端粒DNA的延伸,因此我們發(fā)現(xiàn)假絲酵母TERT具有一個典型的逆轉(zhuǎn)錄酶的功能。本研究中的假絲酵母端粒RNA的重復序列有23個堿基,不像哺乳類端粒酶只有6個重復堿基。那么端粒酶在啟動第二輪延伸時,23個已經(jīng)配對的堿基是如何被打開也是我們關(guān)心的重要問題,有文獻報導假絲酵母Pif1在撞擊端粒酶然后行使解旋酶的功能,從而進行第二輪延伸,我們在研究中意外的發(fā)現(xiàn)假絲酵母Pif1(Capif1)具有3’-5’外切的活力。最近的研究中頻繁的發(fā)現(xiàn)聚合酶,解旋酶具有3'-5'外切酶的活力,研究中我們分析了Pif1家族從細菌到人類的基因序列,發(fā)現(xiàn)一些序列保守的物種不但具有解旋活力還具有外切活力。而這個外切活力的序列不與解旋的活力中心在同一區(qū)域,各自執(zhí)行著不同的功能。我們通過突變兩個保守金屬結(jié)合位點,使酸性氨基酸“E”突變成中性的氨基酸“A”后,CaPif1的外切活力基本喪失,這使得我們更加確定CaPif1不僅有解旋酶的功能,同時還具有外切酶的能力。同時我們根據(jù)同源序列的比較又找出8個物種的Pif1蛋白,發(fā)現(xiàn)其中細菌(BsPif1),人(hPif1),熱帶假絲酵母(CtPif1),啤酒酵母(ScPif1)(極弱),并沒有外切酶活力。而熱帶念珠菌(MgPif1),范氏酵母(VpPif1)和杜氏假絲酵母(Cd Pif1).展現(xiàn)出了外切酶活力。新活力的發(fā)現(xiàn)讓我們從新考慮Pif1在細胞內(nèi)發(fā)揮的作用,切除掉端粒酶在聚合中出現(xiàn)的錯配堿,或者端粒末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)以保護端粒DNA被切除等。以上這些新的發(fā)現(xiàn)為研究端粒酶聚合并修正錯配的DNA分子時的作用機制提供了新的見解。
[Abstract]:In this study , we found that the recombinant telomerase reverse transcriptase ( RT ) is a special reverse transcriptase ( RT ) . It is a special reverse transcriptase ( RT ) to maintain the ability of RNA subunits in the designated region of eukaryotic cells . These new findings provide new insights into the mechanism of telomerase polymerization and the modification of mismatched DNA molecules .

【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1392303