本文關(guān)鍵詞：可溶性鳥苷酸環(huán)化酶H-NOX結(jié)構(gòu)域一氧化碳結(jié)合態(tài)的結(jié)構(gòu)研究　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 可溶性鳥苷酸環(huán)化酶 Ns H-NOX 一氧化碳 水氫鍵 共振拉曼光譜

【摘要】：可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble Guanylate Cyclase,s GC)是一種含血紅素的卟啉蛋白,在高等生物體內(nèi)的NO-c GMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中催化GTP生成第二信使c GMP,調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及細(xì)胞的凋亡等生命代謝活動。s GC由一對異源二聚體組成,分別為不含卟啉的α亞基和含卟啉的β亞基,其中β亞基N端的194個氨基酸(s GCβ1_(1-194)H-NOX)是已知的能夠穩(wěn)定結(jié)合卟啉的最小片段。作為NO受體酶,s GC對氣體配基的結(jié)合性質(zhì)有著重要的意義。一直以來,s GC的全酶只能從動物臟器、組織中提取,耗時很長而且提純量很少。隨著技術(shù)的發(fā)展,來源于細(xì)菌具有高度保守序列和s GC高同源性的H-NOX家族蛋白的發(fā)現(xiàn),為表達(dá)s GC奠定了基礎(chǔ),選擇適合的宿主和載體可以實(shí)現(xiàn)H-NOX家族蛋白和s GCβ1亞基片段的表達(dá)。Ns H-NOX是目前發(fā)現(xiàn)的H-NOX家族蛋白中與s GC同源性最高的一類蛋白和s GCβ1_(1-194)H-NOX一起因與s GC高度一致的序列組成和相似的氣體配位性質(zhì)成為了研究s GC結(jié)構(gòu)與功能的新焦點(diǎn)。在本論文的研究中,我們構(gòu)建了s GCβ1_(1-194)H-NOX(p ET-20b+s GCβ1_(1-194))和Ns H-NOX(p UC19+anaerobic promoter+hnox)的原核表達(dá)體系,用大腸桿菌作為宿主表達(dá)得到了純度較高的s GCβ1_(1-194)H-NOX和Ns H-NOX。Ns H-NOX和s GCβ1_(1-194)H-NOX與s GC全酶有著極其相似的氣體結(jié)合性質(zhì)。為了研究H-NOX結(jié)構(gòu)域的一氧化碳(CO)結(jié)合性質(zhì)以及CO結(jié)合態(tài)蛋白的結(jié)構(gòu)變化,我們分別通過共振拉曼光譜(r RS)和分子動力學(xué)模擬(MD)以及密度泛函理論計算(DFT)的方法來探討這一問題。在對Ns H-NOX和s GCβ1_(1-194)H-NOX的共振拉曼光譜研究中我們發(fā)現(xiàn)兩種蛋白都存在類似于s GC全酶的兩種不同的Fe-CO伸縮振動模式(v Fe-CO),相對應(yīng)的存在兩種不同的CO結(jié)合態(tài)也就是存在兩種不同的CO配位結(jié)構(gòu)。通過對不同長度的s GCβ1片段和s GC全酶以及我們的樣品進(jìn)行高斯擬合分峰處理,Ns H-NOX的v Fe-CO出現(xiàn)在494cm-1和470cm-1,而s GCβ1_(1-194)H-NOX則出現(xiàn)在489cm-1和473cm-1且兩種組分的相對比例在不同片段長度的s GCβ1亞基中是不同的,進(jìn)一步說明了每一種v Fe-CO振動模式對應(yīng)著一種不同的CO結(jié)合態(tài)結(jié)構(gòu),而且在不同的蛋白中這兩種不同結(jié)構(gòu)所占的比例不同。在前期工作中,利用Ns H-NOX晶體結(jié)構(gòu)為模板模建了s GCβ1 H-NOX的3D模型,本研究中對s GCβ1 H-NOX和Ns H-NOX在CO結(jié)合時的結(jié)構(gòu)變化和400ns內(nèi)的分子動力學(xué)軌跡進(jìn)行了討論。150ns后,在s GCβ1 H-NOX中,水分子在CO附近大量聚集,而在Ns H-NOX中,水分子僅有少量分布。在s GCβ1H-NOX中,由于αF螺旋的112位酪氨酸(Y112)和αD螺旋與αE螺旋之間的83位酪氨酸(Y83)能夠形成氫鍵網(wǎng)絡(luò),使αF螺旋發(fā)生扭曲,導(dǎo)致其上方血紅素卟啉大環(huán)發(fā)生位移,形成了可以容納水分子進(jìn)出的水通道,水分子通過這個通道進(jìn)入到了血紅素遠(yuǎn)端口袋,與軸向的CO之間形成了氫鍵網(wǎng)絡(luò)。而Ns H-NOX中112位是苯丙氨酸(F112)不能形成氫鍵網(wǎng)絡(luò),沒有水分子可以進(jìn)入的通道,CO附近不存在長時間停留的水分子,但是仍然有極少部分水分子可以以其他的方式進(jìn)入遠(yuǎn)端口袋內(nèi)部,與CO之間形成部分氫鍵。s GCβ1_(1-194)H-NOX的遠(yuǎn)端血紅素口袋更多的暴露在溶劑中,以及水分子遷移通道的存在,導(dǎo)致s GCβ1_(1-194)H-NOX與Ns H-NOX相比有更快的氧化速率。為了驗(yàn)證水分子進(jìn)入到血紅素遠(yuǎn)端口袋影響了CO結(jié)合態(tài)的結(jié)構(gòu)的推論,我們通過DFT量化計算的方法對(Im H)Fe P(CO)體系在水分子存在條件下的拉曼光譜進(jìn)行了計算,計算結(jié)果與共振拉曼實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。我們討論了幾種具有不同極性的氫鍵供體H2S,NH3,H2O,HF對氫鍵形成與否與不同氫鍵強(qiáng)度下(Im H)Fe P(CO)體系的軌道能級分布、電荷密度分布。在水分子氫鍵存在的體系中,卟啉大環(huán)平面上四個N原子周圍電荷密度減小,中心Fe原子電荷密度增加,而在卟啉軸向上,Fe原子和C原子之間電荷密度明顯增大,說明C原子和Fe原子之間的相互作用增強(qiáng),反映在拉曼光譜上為v Fe-CO的頻率增大,Fe-CO之間形成反饋鍵,Fe的dπ電子進(jìn)入CO的π*軌道,降低了CO內(nèi)部成鍵強(qiáng)度,隨著氫鍵的增強(qiáng),C-O之間的電荷密度明顯的降低,表明C原子和O原子之間的作用變?nèi)?v C-O振動頻率變小。H-NOX結(jié)構(gòu)域Fe-CO的伸縮振動v Fe-CO出現(xiàn)在兩個不同位置的原因在于存在能夠進(jìn)入到血紅素遠(yuǎn)端口袋中的水分子與配位的CO的O形成氫鍵,從而改變了Fe-CO的振動模式,同時也代表著兩種不同CO結(jié)合態(tài)結(jié)構(gòu)的存在。即在較高波數(shù)的為形成氫鍵的Fe-CO…HOH的振動模式,而較低波數(shù)的是Fe-CO不形成氫鍵的振動模式。我們對s GCβ1 H-NOX和Ns H-NOX的CO結(jié)合態(tài)的結(jié)構(gòu)研究,對于進(jìn)一步闡明可溶性鳥苷酸環(huán)化酶s GC的激活機(jī)制、s GC和H-NOX家族蛋白的結(jié)構(gòu)功能以及相關(guān)藥物的研發(fā)具有重要的意義。
[Abstract]:Soluble guanylate cyclase (soluble Guanylate Cyclase, s GC) is a heme porphyrin protein catalyzed by GTP NO-c GMP signal transduction pathway in higher organisms in the formation of the second messenger C GMP, regulating the cardiovascular system, nervous system and cell apoptosis of life and metabolic activity of.S GC by a heterologous two dimers, respectively, alpha subunit containing porphyrin and porphyrin containing beta subunit of 194 amino acids including beta subunit N end (s GC beta 1_ (1-194) H-NOX) is known to be stable with minimum porphyrin fragment. As NO receptor enzyme, has an important significance of the combination GC on the properties of s gas ligands. Since the s GC holoenzyme only from animal organs, tissues, are time-consuming and purification of few amount. With the development of technology, from bacteria to highly conserved s and GC high homology of H-NOX family proteins found for the table Laid the foundation of s GC, select the appropriate host and vector can achieve H-NOX protein family and s GC beta 1 subunit fragment of.Ns H-NOX expression is found in the H-NOX protein family in s GC with the highest homology of proteins and s GC beta 1_ (1-194) H-NOX and s GC sequence with gas highly consistent composition and similar coordination properties has become a new focus of research on the structure and function of s GC. In this paper, we constructed the s GC beta 1_ (1-194) H-NOX (P ET-20b+s GC 1_ (1-194)) and Ns H-NOX (P UC19+anaerobic promoter+hnox) prokaryotic expression system. Using Escherichia coli as the host expression of the high purity of the s GC beta 1_ (1-194) H-NOX and Ns H-NOX.Ns H-NOX and s GC beta 1_ (1-194) H-NOX and s GC enzyme has a similar binding properties of the gas. In order to study the H-NOX domain of carbon monoxide (CO) and CO binding properties of bound protein the Structural changes, we respectively through resonance Raman spectroscopy (R RS) and molecular dynamics simulation (MD) calculation and density functional theory (DFT) method to study the problem. In the Ns H-NOX and s GC 1_ (1-194) resonance Raman spectroscopy in the study of H-NOX we found that two proteins are two different Fe-CO stretching mode is similar to the s GC holoenzyme (V Fe-CO), corresponding to two different CO bound is also there are two kinds of CO coordination structure. According to the different length of the s beta 1 GC fragment and s GC holoenzyme and our sample of Gauss fitting peak processing, Ns H-NOX V Fe-CO in 494cm-1 and 470cm-1, and s GC beta 1_ (1-194) is different from that of H-NOX appears in the relative proportion of 489cm-1 and 473cm-1 and two kinds of components in different fragment length s GC beta 1 subunit, further explains each V Fe-CO vibration mode a corresponding Different CO bound structure, and in different protein structure of the two different proportion. In previous work, the 3D model using Ns H-NOX s GC beta crystal structure built as template model for 1 H-NOX, the study of s GC H-NOX and Ns H-NOX in beta 1 CO binding when the structure of molecular dynamics trajectory change and 400ns were discussed after.150ns in the s GC beta 1 H-NOX, water molecular aggregation in the vicinity of the CO large, while in Ns H-NOX, only a small amount of the distribution of water molecules. In the s GC beta 1H-NOX, the tyrosine 112 alpha helix F (Y112) 83 between tyrosine and alpha D alpha E spiral and spiral (Y83) can form a hydrogen bond network, the alpha F spiral twist, lead to the above the heme macrocycle displacement, the formation of water channel can contain water molecules and water molecules through the channel into the heme distal pocket, and axial CO Between the formation of a hydrogen bond network. While the Ns H-NOX 112 (F112) is a phenylalanine cannot form hydrogen bond network, no water molecules can enter the channel, CO does not exist near the water molecule stays for a long time, but there are still a few water molecules can enter the distal end of internal bag in other ways, part of the hydrogen.S GC beta the formation of 1_ and CO (1-194) H-NOX of the distal heme pocket more exposed to the solvent, and the existence of water molecule migration channel, resulting in s GC beta 1_ (1-194) H-NOX and Ns H-NOX have faster oxidation rate compared. In order to verify the water into the heme distal pocket of CO combined with corollary state structure the method we calculated by DFT (Im H) to quantify the Fe P (CO) system was calculated in the presence of water molecules under the conditions of Raman spectra, the calculated results agree with experimental results. The resonance Raman we discussed several Different polar hydrogen bond donor H2S, NH3, H2O, HF on the formation of hydrogen bonds and hydrogen bond strength under different (Im H) Fe P (CO) orbital distribution system, the distribution of charge density. In the presence of hydrogen bonded water molecules of porphyrin macrocycle plane four N atomic charge density around. Fe, atomic charge density increased, and in axial, between Fe and C atoms in the charge density increased significantly, indicating a stronger interaction between C and Fe atoms, reflected in the Raman spectra for V Fe-CO frequency increases feedback bond formation between Fe-CO and Fe D CO into the pi pi electron * track, reduce the CO internal bond strength, with hydrogen bonds increased, the charge density between C-O decreased obviously and that between C and O atoms becomes weaker, V Fe-CO V C-O stretching vibration frequency of small.H-NOX domain Fe-CO appeared in two different positions of reason It is the existence of water molecules that can enter into the heme distal pocket and form hydrogen bonds with the O of the coordinated CO, thus changing the vibrational mode of Fe-CO. It also represents the existence of two different CO binding states. That is, the Fe-CO with hydrogen bonds at higher wavenumber. The vibration modes of HOH, while the lower wavenumber is vibration mode Fe-CO cannot form hydrogen bond. Research on structure of S combined with our GC beta 1 H-NOX and Ns H-NOX CO, to further elucidate the mechanisms of activation of soluble guanylate cyclase s GC, plays an important role in structure and function of s GC and H-NOX development protein family and related drugs.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55

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本文編號：1362281